ייצור מערכת חלקיקים דמוית נגיף SARS-CoV-2 לחקירת מחזורי חיים נגיפיים במבחנה

אנו מציגים פרוטוקול מבחנה אופטימלי לייצור חלקיקים דמויי נגיף SARS-CoV-2 המחקים באופן הדוק את הנגיף האותנטי. גישה זו מאפשרת לחקור מנגנוני זיהום, הרכבה ויציאה של זיהום נגיפי ללא האילוצים של דרישת מעבדת בטיחות ביולוגית ברמה 3.

המחקר שלנו מתמקד בהבנת הביולוגיה של נגיף SARS-CoV-2 ומנסה למצוא תרופות, במיוחד מהרפואה הסינית נגד SARS-CoV-2. כל מחקר נגיף ה-SARS-CoV-2 החי חייב להיות מבוקר במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית שלוש. והמגבלה הניסויית הזו הופכת מחקר SARS-CoV-2 לאפשרי רק בקומץ חיים. נגיף SARS-CoV-2 כמו שיטה מעשית למחקר על SARS-CoV-2 אפשרי ללא הגבלה של מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית שלוש, והרשימה תהיה שיטה שימושית מאוד.

[מדריך] כדי להתחיל, זרעו כ-3 מיליון תאי HEK-293T בצלחת תרבית רקמה בקוטר 10 סנטימטר עם מדיום שלם DMEM, בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך כ-24 שעות. בדוק את שטף התאים תחת המיקרוסקופ. לדלל 60 מיקרוליטר PEI מתמיסת מלאי של מיליגרם אחד למיליליטר עם מדיום נטול סרום כדי להגיע לנפח סופי של 200 מיקרוליטר. כעת, קח 200 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום והוסף לתוכו 6.7 מיקרוגרם של פלסמיד N, 10 מיקרוגרם של פלסמיד Luc-T20, 0.016 מיקרוגרם של פלסמיד S ו-3.3 מיקרוגרם של פלסמיד M-IRES-E. הוסף בעדינות את תמיסת PEI המדוללת לתמיסה המכילה ציפוי פלסמידים לחלבוני מבנה ויראלי ודגר את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. זהו פתרון הטרנספקציה. זרוק בזהירות את תמיסת הטרנספקציה על תאי HEK-293T וסובב בעדינות את צלחת תרבית הרקמה כדי להבטיח ערבוב יסודי. החלף את מדיום תרבית התאים במדיום שלם DMEM שש שעות לאחר ההדבקה, ודגירה על תאי HEK-293T שעברו טרנספטציה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 48 שעות. אסוף את הסופרנטנט של תאי HEK-293T הנגועים, המכיל חלקיקים דמויי נגיף SARS-CoV-2. סנן את הסופרנטנט שנאסף דרך מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר כדי להסיר פסולת תאית. זהו מדיום SC2-VLP. זרע 40,000 תאי HEK-293T עם ביטוי יציב של אנזים ממיר אנגיוטנסין 2, או ACE2, ו-TMPRSS2 בצלחת של 96 בארות, והוסף 50 מיקרוליטר של מדיום SC2-VLP. דגרו על צלחת תרבית הרקמה בת 96 הבארות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. לאחר הדגירה, הסר את המדיום מכל באר בצלחת 96 הבארות, ושטוף פעם אחת עם 100 מיקרוליטר PBS שחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס. ליז את תאי ה-HEK-293T שנזרעו עם תאי TMPRSS2 ACE2 עם 20 מיקרוליטר של מאגר ליזה פסיבי, ולנענע בעדינות את הדגימה על שייקר אורביטלי למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. סובב את צלחת 96 הבארות ב -4,000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגה מיקרופלייטית מקוררת, ולאחר מכן העביר מיד את הצלחת לאמבטיית קרח. קח 100 מיקרוליטר של מאגר בדיקת לוציפראז משוחזר לצלחת לבנה אטומה חדשה של 96 בארות, והוסף 20 מיקרוליטר ליזט לכל באר. מערבבים קצרות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פעמיים-שלוש. מדוד את אות הזוהר באמצעות קורא צלחות. לאחר מכן, כדי להעריך את הרכב המדיום SC2-VLP, הוסף 1.36 מיליליטר של תמיסת PEG 8000 ל-10 מיליליטר של מדיום SC2-VLP. מניחים את התערובת על שייקר אורביטלי ומערבבים לאט בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. צנטריפוגה את התמיסה בארבע מעלות צלזיוס ו -2,000 גרם למשך 30 דקות. ולאסוף את גלולת SC2-VLP לניתוח כתמים מערביים. זרעו כ-3 מיליון תאי HEK-293T באופן שווה בצלחת תרבית עם תחתית זכוכית בקוטר 15 מילימטר, ואפשרו לתאים להיצמד ולגדול עד שהם מגיעים לכ-70% מפגש. לאחר מעבר התאים כפי שהודגם קודם לכן עם כמויות הפלסמיד שהשתנו, שטפו בעדינות את צלחת התרבות פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS קר כקרח. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת קיבוע אלדהיד פרפורמית 4% בטמפרטורת החדר, ודגירה למשך 15 דקות. שטפו את התאים פעמיים במשך חמש דקות כל אחד עם מיליליטר אחד של PBS בטמפרטורת החדר, וחלחלו לתאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.25% טריטון X-100 למשך 10 דקות. שוב, שטפו את התאים פעמיים במשך חמש דקות כל אחד עם מיליליטר אחד של PBS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של אלבומין בסרום בקר 5% למשך שעה כדי לחסום אינטראקציות נוגדנים לא ספציפיות. הוסיפו כ-200 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית כדי לכסות את תחתית הזכוכית, ודגרו בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטוף את התאים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם מיליליטר אחד של PBS בטמפרטורת החדר. כעת, הוסיפו תמיסת נוגדנים משנית מצומדת פלואורסצנטית ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים עם PBS, יש לצבוע את הגרעינים ב -2.5 מיקרוגרם למיליליטר של תמיסת Hoechst בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לבסוף, לאחר שטיפת התאים עם PBS, התבונן בצביעת חלבון S או אברון לפני רכישת תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. איור זה ממחיש את הרגישות של ייצור SC2-VLP לכמויות טרנספקציה משתנות של הפלסמיד המקודד את חלבון הספייק. טיטר SC2-VLP היה הגבוה ביותר כאשר 0.016 מיקרוגרם של פלסמיד S הועברו וירד משמעותית עם 0.16 ו-1.6 מיקרוגרם של פלסמיד S. המוטציה H1271 ל-E בחלבון הספייק הפחיתה משמעותית את טיטר SC2-VLP בהשוואה לסוג בר. המוטציה E1262 ל-H הובילה להפחתה מתונה בטיטר SC2-VLP, בעוד שהמוטציה הכפולה E1262 ל-H, H1271 ל-E ביטלה לחלוטין את הייצור. רצועות חלבון S ו-S-2 באורך מלא הופחתו בנתיבי E1262 עד H ומוטנטיים כפולים, בהשוואה לסוג פראי. יעילות אריזת S הופחתה גם במוטציות E1262 ל-H ו-H1271 ל-E וכמעט בוטלה במוטציה הכפולה. שפע ה-VLP נותר כמעט ללא שינוי בין מוטציות הבר וכל מוטציות ה-S. חלבון S מסוג פרא שנמצא במקביל לסמן cis-Golgi GM130, אך לא עם סמן ER Sec61 beta או סמן ERGIC ERGIC 53. חלבון ה-S המוטנטי H1271 ל-E הראה פיזור ציטופלזמי מפוזר וחסר קו-לוקליזציה עם GM130.