מדריך מדורג לבידוד וניתוח של משטח העלים ו-RNA אפופלסטי באמצעות רוזטות Arabidopsis

אנו מנסים להבין כיצד צמחים מווסתים את המיקרוביום שלהם והאם רנ"א המופרש על ידי צמחים מווסת את ביטוי הגנים הן במיקרובים פרוקריוטיים והן באיקריוטיים המאכלסים צמחים. אנו משתמשים בשילוב של אלקטרופורזה של מעטפת ברזולוציה גבוהה וניתוח מבוסס Illumina כדי להעריך את ה-RNA הקיימים על פני העלה וכיצד הם משתנים בתגובה ללחץ ביוטי. בעוד שמחקרים אחרונים מצביעים על כך ש-RNA חוץ-תאי נקלט על ידי פתוגנים פטרייתיים וחיידקיים, המנגנונים הבסיסיים של ספיגת RNA וההשלכות התפקודיות של ספיגה זו נותרו ברובם לא נחקרו.

כדי להתחיל, קח צמחי ארבידופסיס בני שישה עד שבעה שבועות לכל שכפול. הוסף צללית L-77 ל-VIB הסטרילי, לפני שתתחיל בבידוד של שטיפת משטח העלים. לאחר מכן, בעזרת גליל מדידה, העבירו 100 מיליליטר מתמיסת ה- VIB המוכנה לבקבוק ריסוס של 500 מיליליטר.

בעזרת מספריים עדינים נתק בזהירות את שושנות הערבידופסיס משורשיהן. לאחר מכן, השתמש במברשת רכה כדי להסיר עודפי אדמה מעלי הכותרת. הניחו את הרוזטות המנותקות על מגש שטוח כשהמשטח האבקסיאלי פונה כלפי מעלה.

לאחר מכן רססו את המשטח האבקסיאלי באמצעות חמש משאבות של בקבוק הריסוס המלא ב-VIB וחומר הרטבה. הפוך בזהירות את הרוזטות ורסס את המשטח האדקסיאלי. הכן מזרקים ששונו עם חורים בתחתית על ידי עטיפתם בסרט פרה סביב הצוואר כדי לתלות את הקצה מעל תחתית הבקבוק.

כדי לשחזר את שטיפת משטח העלים, הכנס בעדינות את הרוזטות המרוססות למזרקים ללא מחט של 60 מיליליטר המונחים בתוך בקבוקי צנטריפוגה של 250 מיליליטר, ורסס שתי משאבות חיץ יציבות לתוך המזרק. לאחר מכן צנטריפוגה את הבקבוקים העמוסים ב 100 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כעת מסננים את משטח העלים המשוחזר שוטפים דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר ואוספים את המסנן בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר, הנשמר על קרח.

לשיטת ספוגית פני העלים, יש לרסס את הרוזטות המנותקות בתמיסת ה-VIB וחומר ההרטבה באותו אופן כמתואר בשלב הקודם. כדי לשחזר את ספוגית פני העלה, השתמש במקלות קצה כותנה סטריליים כדי לספוג את המשטחים האדקסיאליים והאבקסיאליים של השושנות. לאחר מכן לחץ את הקצוות הספוגים על הדופן הפנימית של צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר כדי לחלץ את הנוזל.

סנן את דגימת ספוגית משטח העלים שחולצה, דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר לתוך צינור של שני מיליליטר המונח על קרח. מניחים את אותה קבוצת צמחים ששימשה בעבר לשטיפת משטח עלים או בידוד ספוגית בכוס נקייה ושוטפים אותם בעדינות פעמיים במים מזוקקים. כדי לחדור לרוזטות עם VIB, הנח בזהירות את הרוזטות השטופות למכונת קפה צרפתית המכילה 300 עד 500 מיליליטר VIB.

אבטח את המכסה והורד בעדינות את הבוכנה עד שהרוזטות שקועות לחלוטין. הכנס את המכבש הצרפתי לתא ואקום והחל ואקום למשך 20 שניות באמצעות משאבת ואקום עד שהצמחים חודרים היטב. לאחר שחרור הוואקום, הסר את המכבש הצרפתי מהתא והסר את המכסה.

יוצקים את ה- VIB לכוס פלסטיק של 500 מיליליטר ומסירים את הרוזטות. לאחר מכן מנערים בעדינות את הרוזטות ומברישים את העלים על מגבת נייר כדי להסיר עודפי חיץ. כעת, בעזרת נייר סופג, כתם בעדינות את משטחי העלים כדי להסיר את כל המאגר שנותר.

כדי לאסוף את נוזל הכביסה האפלסטי, הכנס את הרוזטות שחדרו VIB למזרקים ללא מחט של 60 מיליליטר, המונחים בתוך בקבוקי צנטריפוגה של 250 מיליליטר כפי שנעשה בעבר. צנטריפוגה את הבקבוקים ב-600 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם תאוצה איטית. לאחר מכן מסננים את נוזל הכביסה הפלסטי המאוגד דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר בצינור של 15 מיליליטר המונח על קרח.

הכן או רכוש מיני ג'ל המכיל 10 או 15% פוליאקרילאמיד ושבע אוריאה מולרית במאגר EDTA חומצה טריסבורית, באמצעות תמיסת אקרילאמיד וביס לאחר מכן מערבבים את דגימות ה-RNA עם מאגר טעינת דנטור פעמיים. מחממים את התערובת בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות ומיד מניחים אותה על קרח.

כעת פתרו את דגימות ה-RNA במאגר רץ TBE פי 0.5 בטמפרטורת החדר על ידי הפעלת 220 וולט למשך כשעה ו-15 דקות. לאחר מכן מכתים את הג'ל בצבע ג'ל חומצת גרעין סייבר זהב ב-0.5 פעמים TBE למשך 10 דקות. שטפו את הג'ל פעמיים במים מזוקקים ודמו אותו באמצעות מערכת הדמיה.

כדי לכמת את רצועות ה-RNA שנפתרו, השתמש בשיטת ניתוח הג'ל מהתיעוד של Image J תחת תפריט הניתוח וניתוח הג'ל. הכן תקני RNA לשני שכפולים טכניים על ידי דילול RNA ליזאט תאים במים נטולי RNase ו-DNase. כדי להכין כתם ג'ל של חומצת גרעין זהב פי 1.5, יש להמיס אותו במאגר טריס HCL של 500 מילי-מולרית ב-pH שמונה.

להגדרת המיקרופלייט, הוסף 99 מיקרוליטר מים מזוקקים לכל באר. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של RNA לכל באר תוך שימוש באותו נפח הן עבור דגימות RNA והן עבור תקנים. לבסוף, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת סייבר זהב לכל באר.

כדי להגדיר את הפרמטרים של קורא לוחות המיקרו, בחר טלטול ליניארי או מסלולי למשך שלוש שניות. הגדר את קורא לוחות המיקרו למצב נקודת קצה פלואורסצנטית עם אורך גל עירור של 496 ננומטר ואורך גל פליטה של 540 ננומטר. בנה קו כיול, תוך שימוש בערכי עוצמת הקרינה מתקני RNA.

ניתוח ג'ל RNA לדנטורינג גילה כי גם דגימות שטיפת משטח עלים וגם דגימות נוזל שטיפה אפלסטי מכילות מגוון רחב של גדלי RNA, כולל מיני RNA ארוכים וקטנים כאחד. כמויות ה-RNA הכוללות שבודדו מנוזל הכביסה האפלסטי ושטיפת משטח העלים היו דומות, כאשר נורמלו למשקל טרי של הצמח. פרופילי ה-RNA של שטיפת משטח העלים, שטיפת הפלסטיק וליזאט התאים שונים באופן ניכר, מאשרים זיהום RNA תוך-תאי מינימלי ומראים כי RNA אפלסטי מעובד מאוד עם רצועות מפוזרות במשקל מולקולרי נמוך תוספת של 0.001% צללית L-77 למאגר בידוד השלפוחית כמעט הכפילה את תפוקת ה-RNA ממשטחי העלים בהשוואה למאגר ללא חומר ההרטבה.

אך הגדלת ריכוז זה ל-0.01% לא שיפרה עוד יותר את התאוששות ה-RNA. שטיפה שנייה של אותם עלים החזירה כ-63% מה-RNA שהתקבל בשטיפה הראשונה, מה שמעיד על הפרשת RNA מתמשכת על פני העלה. כימות RNA, באמצעות מבחני לוחות מיקרוטיטר מבוססי פלואורסצנטיות, הראה ליניאריות גבוהה עם ריכוז RNA הן עבור שיטות זיהוי סייבר זהב והן עבור שיטות זיהוי RIBO 488.

הראינו כי מקטעים שמקורם ב-tRNA ו-tRNA, או TDRs, נמצאים בשפע במיוחד ב-RNA חוץ-תאי, ככל הנראה בשל עמידותם בפני פירוק. לכן אנו מאמינים ש-TDRs אלה ככל הנראה מווסתים את ביטוי הגנים בחיידקים. אנו רוצים לזהות את המקורות התאיים של RNA פני העלה ואת התפקידים הביולוגיים שעשוי למלא RNase זה על פני העלה בהקשר של אינטראקציות מיקרואורגניזמים מתוכננות.