הדמיה חיה ואפיון של דינמיקת מיקרוגליה ואינטראקציות עם סינפסות ברשתית עכברים חולים
January 16th, 2026
מאמר זה מדגים שיטה לדמיון וכימות תנועתיות מיקרוגליה ומגע עם פונקטות פוסט-סינפטיות ברשתית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.
היקף המחקר במעבדתנו הוא לחקור את המנגנונים הבסיסיים של גלאוקומה ומיקרוגליה בעיצוב מחדש של סינפסות במהלך ההתפתחות. האתגרים הניסיוניים הנוכחיים מתמקדים בשאלה האם מיקרוגליות מפרקות באופן פעיל סינפסות תאי גנגליון רשתית או שמא הן פשוט מנקות פסולת באופן פסיבי. התחל עם רשתית העכבר שמונחת על נייר סינון וייבש אותה במגבון מעבדה.
הפוך את הרשתית על צלחת פטרי של MatTek. כבדו את הרשתית באמצעות חרוזי מתכת או טבעת. לאחר מכן, הוסיפו שלוש עד חמש טיפות של נוזל מוח-שדרה מלאכותי.
הניחו את הדגימה תחת מיקרוסקופ דיסקי מסתובב והתאימו את ההגדרות לתצוגה מקדימה של הרשתית. אספו תמונות לאורך ציר ה-Z בעומק כולל של 10 עד 20 מיקרומטר באמצעות גודל צעד של 0.3 מיקרומטר. שמור על מרווח הזמן בין הפריימים ל-20 עד 30 שניות כדי לאפשר מעקב אמין של התאים.
כדי לבצע רינדור שטחי של המיקרוגליה, המור את קובץ הטיימלפס לפורמט IMS באמצעות תוכנת ממיר הקבצים. הזן את גדלי הווקסלים בהתבסס על תכונות התמונה שנרכשו קודם. בזירת תוכנות הניתוח, לחץ על תיקיית ה-Observe כדי לפתוח את הקובץ המומר ולוודא שהתמונה בתצוגת תלת-ממד.
כדי לזהות מיקרוגליה בודדת, לחץ על סמל הוסף משטח חדש בסרגל הכלים של האובייקט. בחר רק אזור עניין, עוקב אחר משטחים לאורך זמן, סווג משטחים וסטטיסטיקות אובייקט-אובייקט תחת הגדרות אלגוריתם. לאחר מכן, לחץ על כפתור ההפעלה הכחול כדי להמשיך.
בחר את הערוץ לרינדור שטח. באופן אופציונלי, אפשר להחליק את יצירת המשטחים ולהכניס את פרטי המשטח. מתחת לסף, בחרו בסגמנטציה של למידת מכונה לזיהוי תאים.
מתחת לנתוני האימון, השתמש בכלי מברשת הרקע והקדמת התמונה. צייר משיכות מכחול על ידי בחירת מברשת הצבע הרצויה ושימוש בלחיצה Shift Plus שמאלית. תוודא שהתצוגה באינטרפולציה מופעלת, ואז בחר רכבת וחיזוי.
השתמש במצביע הצהוב במרכז כדי לנווט על ציר ה-Z. צייר מספר קווים על פני מישורי X, Y ו-Z, ועל פני כמה מסגרות זמן. השתמש בשלוש עד חמש פעימות קצרות בכל כניסה, תוך כוונון איטרטיבי עד שנוצר משטח מדויק.
השתמשו במלבן הצהוב כדי לעבור בין תצוגת האימון למשטח שנוצר כבדיקה סופית. בנוסף, בדוק לאורך הזמן שמשטח המשטח תואם למורפולוגיית התא. לאחר הסיום, בטל את הבחירה באובייקטים מפוצלים.
כוון את סף ההיסטוגרמה של הווקסלים כדי להסיר אובייקטים קטנים לא מחוברים שאינם חלק מהמשטח הראשי. לאחר מכן, ערוך את המשטח ידנית כדי להסיר אובייקטים מיותרים או קצוות חתוכים באמצעות כלי המספריים. אם רוצים, קבע סף פערים מותר לאובייקט ובחר את אלגוריתם המעקב לתא הנע.
סנן עקב אחרי אובייקטים שאינם קשורים למשטח הראשי. לאחר הסיום, הגדר את תצוגת התאים הנעים לפרופיל שקוף כדי להמחיש את הפנקטה לצעדים הבאים. כדי לזהות נקודות PSD95 בודדות, לחץ על סמל המשטח הכחול בסרגל הכלים של האובייקט.
לאחר מכן, בחר נקודות מסלול לאורך זמן, סווג נקודות, סטטיסטיקות אובייקט-אובייקט ולחץ על הפעלה. בחר את ערוץ המקור של הסמן הסינפטי. כבה את הסלייסר וערוצים אחרים כדי להמחיש רק את PSD95.
השתמש בכפתור הבקרה ובכלי בחירת המצביע כדי להעריך את קוטר ה-XY של הפונקטה. בחר כמה פונקטות בהירות שנשארות לאורך הפריימים וכבה את חיסור הרקע. לאחר מכן, הוסיפו פילטר לפי איכות הכתם.
כוון את ההיסטוגרמה כך שתכלול פנקטה מדויקת של PSD95 בכל מסגרות הזמן. הסר את הנקודות החיוביות השגויות באמצעות עריכה. החלף בין הקובייה או הסמן המעגלי כדי למחוק נקודות שנמשכות רק פריים או שניים.
אם רוצים, קבע סף פערים מותר ובחר את אלגוריתם המעקב לנקודות סינפטיות. מסננים מסלולי נקודות שאינם קשורים לפנקטה אמיתית באמצעות סף היסטוגרמה כדי להוציא מסלולי אובייקטים קטנים. הגדר סיווגים באמצעות המרחק הקצר ביותר לסיווג פני השטח.
הסט עטוף ככל פונקטה מתחת לאפס מיקרומטרים, במגע בין אפס ל-0.5 מיקרומטר מהשטח, וללא מגע כ-0.5 מיקרומטר מעל השטח. הקצה תוויות לאירועים באמצעות הסיווגים שנמצאו למעלה. ברגע שהמשטחים והכתמים מייצגים כראוי מיקרוגליה ופונקטה, ייצא את כל הסטטיסטיקות תחת לשונית הסטטיסטיקות.
מיקרוגליה הראתה עלייה באורך ההזזת התהליך לאחר יתר לחץ דם עיני שנגרם מלייזר בהשוואה לקבוצת הביקורת. מהירות המיקרוגליה הייתה גבוהה משמעותית בעיניים שטופלו בלייזר מאשר בעיניים בביקורת. מספר אירועי המגע בין מיקרוגליה לפנקטה PSD95 עלה לאחר טיפול בלייזר.
הקלטות טיים-לאפס הראו כי רשתיות שטופלו בלייזר הציגו תנועתיות מיקרוגליאלית גבוהה יותר ואינטראקציות מוגברות עם פונקטה PSD95 בהשוואה לרשתית הביקורת. הממצאים המשמעותיים שלנו הראו כי יש עלייה במספר המיקרוגליה, המורכבות והתנועתיות, וכן בקולוקליזציה סינפטית בעקבות עלייה חולפת בלחץ תוך-עיני בעכברים. הפרוטוקול שלנו מציע הדמיה אקס ויבו, המסייעת למנוע בעיות קטרקט ואטימות בקרנית, ומאפשרת הקמה קלה יותר לניסויים מהירים יותר וקצב תפוקה גבוה יותר.
הממצאים שלנו מקדמים את המחקר על ידי אפשרות לדמיית אינטראקציות בין מיקרוגליה-נוירונים, תקשורת תאית ודינמיקה באמצעות קווי פלואורסצנט טרנסגניים, וכן הדמיית טיים-לאפס ברזולוציה גבוהה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This protocol describes an ex vivo mouse retina explant model to study microglia dynamics and their interactions with synaptic proteins. Using spinning disk confocal microscopy and advanced image analysis, the method enables detailed quantification of microglial motility and synaptic contacts under both homeostatic and injury conditions. The approach is particularly useful for investigating microglia-mediated synaptic pruning in retinal neurodegenerative disease models.
Key Study Components
Area of Science
- Neuroscience
- Cell Biology
- Imaging
Background
- Microglia are the resident macrophages of the CNS, involved in immune responses and synaptic pruning.
- Synaptic pruning by microglia is crucial for neural circuit refinement during development and disease.
- The mechanisms of microglia-mediated synaptic pruning in neuroinflammation and neurodegeneration are not fully understood.
- Retinal explant models allow for controlled ex vivo studies of microglial behavior.
Purpose of Study
- To visualize and quantify microglia motility and their interactions with postsynaptic proteins in the mouse retina.
- To compare microglial dynamics in homeostatic versus injury (laser-induced ocular hypertension) conditions.
- To provide a protocol for high-throughput, high-resolution imaging of microglia-synapse interactions.
Methods Used
- Preparation of mouse retina explants and mounting on filter paper in Petri dishes.
- Labeling of synapses with AAV-PSD95-RFP.
- Time-lapse spinning disk confocal microscopy to capture microglia and synaptic protein dynamics.
- 3D surface and spot reconstruction using image analysis software with machine learning segmentation.
- Quantitative analysis of microglia displacement, process speed, and contact with PSD95 puncta.
Main Results
- Microglia in laser-treated retinas showed increased process displacement length and higher motility compared to controls.
- The number of contact events between microglia and PSD95 puncta increased after laser-induced injury.
- Time-lapse imaging revealed greater microglial complexity and synaptic colocalization following transient intraocular pressure elevation.
- The protocol enabled efficient, high-throughput imaging and analysis, overcoming limitations of in vivo approaches.
Conclusions
- This ex vivo protocol allows detailed visualization and quantification of microglia-synapse interactions in the retina.
- Microglial motility and synaptic contacts are enhanced following neuronal injury.
- The method facilitates studies of microglia-mediated synaptic pruning in neurodegenerative disease models.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative live imaging of microglia-synapse interactions in ex vivo murine retina provides a high-throughput, reproducible platform for interrogating neuroimmune mechanisms relevant to neurodegenerative disease. This approach enables precise measurement of microglial motility and synaptic contact dynamics, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. The protocol's scalability and imaging fidelity facilitate robust portfolio triage and translational continuity for CNS therapeutic programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of microglia-mediated synaptic remodeling under homeostatic and injury conditions.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing active synapse disassembly from debris clearance.
- Provides quantitative metrics for functional target validation in neuroinflammation and neurodegeneration models.
- Facilitates predictive confidence in pathway interrogation for CNS disease targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible imaging outputs for downstream screening workflows.
- Standardizes quantification of microglia motility and synaptic contact events for assay development.
- Enables high-throughput, scalable analysis of cellular interactions using machine learning segmentation.
- Prepares robust biological systems for compound evaluation in neuroimmune modulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns ex vivo findings with disease-relevant mechanisms in retinal neurodegeneration models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by quantifying microglia-synapse dynamics post-injury.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for neuroprotective and immunomodulatory strategies.
- Provides translational biomarker candidates based on dynamic cellular interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging and analysis protocol integrates from early discovery through preclinical research, bridging mechanistic studies and translational validation in CNS disease models.
- Discovery Biology: Quantifies microglia-synapse interactions to clarify neuroimmune pathways and support hypothesis testing.
- Screening: Establishes reproducible, quantitative imaging assays for evaluating candidate interventions.
- Analytics: Extracts displacement, speed, and contact frequency metrics to enable condition comparison and statistical analysis.
- Translational Research: Connects ex vivo cellular dynamics to disease-relevant endpoints in neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for diverse CNS and neuroimmune research pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroimmune target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in imaging-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal imaging, image analysis, and neurobiology.
- Demands access to spinning disk confocal microscopy and advanced analysis software with machine learning segmentation.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data extraction protocols.
- Adaptable to other CNS tissues or disease models with appropriate labeling strategies.
- Throughput and scalability are limited by imaging infrastructure and data processing capacity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:24
Time-Lapse Imaging of Mouse Retina for Tracking Analysis of Microglia and Synaptic Puncta
1:14
Microglial Surface Rendering and Tracking Analysis
3:56
Spot Classification for Postsynaptic Density Protein-95 (PSD95) to Detect Synaptic Puncta
5:54
Results
6:35
Conclusion
