פיתוח מכשיר תאורה חדשני מבוסס LED ליישום במבחנה של טיפול פוטודינמי עם רוז בנגל

היקף המחקר שלנו הוא פיתוח פרויקטים בסיסיים ותרגומיים שמטרתם לאפיין את השפעת הטיפול הפוטודינמי בטיפול בסרטן ללא אפשרויות טיפוליות יעילות. האתגרים הניסויים הנוכחיים הם לפתח את הטכנולוגיות הדרושות ליישום טיפול פוטודינמי מיישום במבחנה ליישום קליני, כולל רגישים לאור ומכשירי תאורה חדשים. בהשוואה לטכניקות אחרות, הפרוטוקול שלנו כולל מכשיר זול ותוצרת בית, המאפשר תאורה נדיבה יותר של צלחת של 96 בארות ואת המצב הפיזיולוגי בתוך אינקובטור תרבית תאים.

כדי להתחיל, הסר את תאי ה- HepG2 המתורבתים מהחממה והנח את הבקבוק מתחת לתחנת הבטיחות המיקרוביולוגית שנוקה מראש. בעזרת פיפטה, הסר את מדיום התרבות מבקבוק התרבות. כדי למנוע שאריות של מדיום, יש לשטוף בתמיסה עם חוצץ פוספט תוך כדי ערבוב עדין, ולאחר מכן להסיר בזהירות את המאגר.

לאחר מכן, מרחו שלושה מיליליטר של תמיסת טריפסין המכילה 0.25% טריפסין ו-0.53 מילי-מולרי EDTA על התאים והחזירו את התרבית לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לנתק את התאים. לאחר חמש דקות, הוסף שבעה מיליליטר של מדיום תרבית לבקבוק כדי לנטרל את הטריפסין ולהשעות את התאים. כעת, העבירו את התאים הטריפסין, המדיום והמנותקים לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.

כדי לספור את התאים, פיפטה 20 מיקרוליטר מתמיסת התא לתוך צינור נקי, והוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת טריפן כחולה. לאחר הערבוב, טען את התערובת המוכתמת על שקופית הספירה והכנס אותה לדלפק התאים. לאחר מכן, הוסף מדיום תרבית לשפופרת, ואז הכנס תאים כדי להגיע לריכוז סופי של 150,000 תאים למיליליטר.

זרע 1.5 כפול 10 בחזקת ארבעה תאים לבאר לצלחת לבנה של 96 בארות עם תחתית ברורה ושטוחה. הכן שתי צלחות לכל זמן קריאת כדאיות. דגרו על הצלחות למשך 24 שעות לפני הטיפול כדי לאפשר לתאים להיחבר.

להכנת תמיסת מלאי של בנגל ורדים, ממיסים אותה בתמיסת מלח של 10%. לדלל את תמיסות הטיפול ברוז בנגל בריכוזים הנעים בין אפס ל-100 מיקרומולר במדיום תרבית תאים. כעת, הסר את מדיום התרבות מלוחות התאים והוסף 100 מיקרוליטר מתמיסות הטיפול בבנגל ורדים מוכנות לכל באר.

דגרו על התאים עם רוז בנגל למשך שעתיים כדי לאפשר הפנמה. לאחר שעתיים, הוציאו את תמיסת הוורדים הבנגליים מכל באר, שטפו את התאים פעמיים עם PBS, שאפו את ה-PBS והוסיפו 100 מיקרוליטר לבאר של מדיום תרבית ללא ורדים בנגליים. מכסים את המיקרו-פלטות בנייר אלומיניום כדי להגן עליהם מפני אור, ומניחים בצד מחצית מהלוחות להארה במהלך בדיקת הטיפול הפוטודינמי.

חבר את המחבר הזכר במפיץ האור למחבר הנקבה של מקור האור. הסר את הטיפול הפוטודינמי ואת המיקרו-פלטות במצב כהה מהחממה. פרקו את צלחת הטיפול הפוטודינמית.

לאחר מכן, הגדר את הדימר על דרייבר ה-LED לרמה המקסימלית כדי לספק קרינה ממוצעת של 0.62 מילי-וואט לסמ"ר על פני 96 הבארות. לאחר מכן, הנח את הצלחת על מפיץ האור. האירו את המיקרופלייט עד להשגת מינון האור הרצוי על התאים.

לאחר הגעה למינון האור הרצוי, כבה את המכשיר. עטפו מחדש את המיקרו-צלחת הטיפולית הפוטודינמית בנייר אלומיניום והחזירו אותה יחד עם לוחית הבקרה לחממה עד לביצוע בדיקת הכדאיות. לאחר השלמת בדיקת הטיפול הפוטודינמי, הנח את הצלחת המוארת באינקובטור למשך 24 שעות כדי לאפשר תגובה תאית לאחר הטיפול.

לאחר תקופת הדגירה, אחזר צלחת אחת מוארת וצלחת אחת לא מוארת. הוסף 100 מיקרוליטר של ריאגנט מערכת בדיקת כדאיות התא לכל באר כדי למדוד את חילוף החומרים המיטוכונדריאלי וייצור ATP. דגרו על הצלחות בחושך למשך 10 דקות לפני שתמשיכו במדידת הזוהר.

לאחר 10 דקות, קרא את הזוהר בכל באר באמצעות קורא רב-מודאלי. קחו בחשבון את הזוהר מבארות הבקרה הלא מטופלות כמייצג 100% כדאיות. נרמל את ערכי הזוהר מהבארות המטופלות לבקרה זו כדי לחשב את אחוז הכדאיות עבור כל מצב טיפול.

חזור על אותו פרוטוקול למדידת כדאיות התא בנקודות זמן נוספות לאחר הטיפול, כגון 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות. תאורה לבדה ללא ורד בנגל לא שינתה את כדאיות תאי HepG2 באף אחד ממינוני האור שנבדקו, ובנגל ורד לבדו ללא אור גם לא גרם לשינוי משמעותי בכל הריכוזים. טיפול פוטודינמי בתיווך רוז בנגל באמצעות CELL-LED-550/3 הפחית משמעותית את כדאיות תאי HepG2 בכל מינוני האור, והראה השפעה ציטוטוקסית חזקה.

החפיפה בין פרופיל פליטת ה-LED לספקטרום הספיגה של ורד בנגל אישרה את התאימות הספקטרלית של מכשיר CELL-LED-550/3 עם הרגישות לאור. בעתיד, אחת המטרות העיקריות שלנו היא לפתח חבילות PDT חדשות שכל אחת מהן מורכבת הן מתרכובת רגישה לאור המאפשרת מיקוד ספציפי של תאים סרטניים והן מכשיר תאורה נלווה.