Ookluc: קו פלסמודיום ברגהיי לזיהוי תרכובות חוסמות שידור

המחקר שלנו נועד לזהות ולאפיין תרכובות חוסמות העברה וגנים חיוניים בשלבי המין של פלסמודיום באמצעות מערכת תפוקה גבוהה כדי לתמוך באסטרטגיות חדשות להפסקת העברת מלריה. פרוטוקול זה מטפל בהיעדר שיטות סטנדרטיות בעלות תפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות חוסמות שידור על ידי שימוש בקו P.berghei טרנסגני עם זיהוי אוטומטי של שלב זוהר של התפתחות טפיל לאחר הפריה. פרוטוקול זה מאפשר סינון של השלבים המיניים של פלסמודיום, מזהה תרכובות חוסמות העברה מוקדמות ותומך בקביעת IC50 מדויקת, ומציע יתרונות על פני שיטות קונבנציונליות.

כדי להתחיל, הכינו את דגימות התרכובת על ידי דילול מלאי התרכובת למילימולרית אחת באמצעות מדיום אוקינט. הכן את דגימות העבודה על ידי דילול מלאי מילי-מולרי זה במדיום אוקינט ביחס של 1 ל-100 כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרומולר. לבדיקה אחת, הכינו נפח סופי של 200 מיקרוליטר של דגימת עבודה בשכפול.

אם התרכובת מומסת בממס שאינו מים, הכינו דגימת בקרה על ידי דילול הממס במדיום האוקינט באותה פרופורציה המשמשת לדגימת הבדיקה. באמצעות שתי צלחות של 96 בארות, הנח 80 מיקרוליטר מכל דגימה בבארות ייעודיות לבקרה חיובית, בקרה שלילית, בקרת ממס ודגימות בדיקה בשכפול בהתאם לפריסה הנתונה. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של דם עכבר טפיל לכל באר ביחס של 1 ל-20, למעט בארות הבקרה השליליות.

הומוגניזציה בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לבקרה השלילית, הוסף דם עכבר לא נגוע לכל באר ביחס של 1 ל-20 והומוגניזציה בעדינות על ידי פיפטינג. מניחים את הצלחות באינקובטור המוגדר ל-21 מעלות צלזיוס, ומדגרים במשך שש שעות או 24 שעות.

לאחר הדגירה, הפוך כל דגימה להומוגניזציה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כדי להבטיח ערבוב נכון של מדיום הדם. הכן את תערובת מאגר הליזיס ומצע הלוציפראז ביחס של אחד ל-50 מיד לפני השימוש. מערבבים את תערובת מצע חיץ הליזיס הזו עם כל דגימה ביחס של אחד לאחד, ומבטיחים ערבוב עדין מבלי להכניס בועות.

דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות. כעת, העבירו את הדגימות לצלחת לבנה בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות ומדדו את הזוהר באמצעות קורא צלחות. לאחר בדיקת הזוהר, רשום את נתוני הזוהר הגולמיים המוצגים על ידי קורא הלוחות.

באמצעות גיליון אלקטרוני, חשב את הממוצע של כל מדידה באמצעות הנוסחה הנתונה. החלף את XX בכתובת של תא המדידה הראשון ואת YY בכתובת של תא המדידה השני. חזור על הנוסחה עבור כל הדוגמאות.

המר את הנתונים לעיכוב באחוזים באמצעות הנוסחה הנתונה, כאשר A הוא ערך יחידת האור היחסית לדוגמה ו-B הוא ערך יחידת האור היחסית של הבקרה. בחר תרכובות המציגות יותר מ-95% עיכוב עבור ריכוז מעכב של 50% קביעה. לאחר הדבקת עכברים ב-Ookluc ואיסוף דם טפיל, הכינו דגימות תרכובת באמצעות מדיום אוקינט כמדלל בריכוז הראשוני שהראה עיכוב של 100% בהמרה.

פיפטה הדגימות משולשות לצלחת של 96 בארות בהתאם לפריסה שצוינה. באמצעות פיפטה, בצע דילול סדרתי כפול על ידי העברת 80 מיקרוליטר מבאר D1 ל-D2, ערבוב יסודי, ולאחר מכן העברת 80 מיקרוליטר מ-D2 ל-D3 והמשך תהליך זה עד D12. השלך את 80 המיקרוליטרים האחרונים שהוסרו מ-D12 כדי לשמור על 80 מיקרוליטר לבאר.

כעת, הוסף דם עכבר טפיל לכל באר ביחס של 1 ל-20 והומוגניזציה בעדינות על ידי פיפטינג. בבארות הבקרה השליליות, הוסף דם עכבר לא נגוע ביחס של 1 ל-20 והומוגניזציה בעדינות. הנח את הצלחת באינקובטור המוגדר ל-21 מעלות צלזיוס, ודגירה במשך שש או 24 שעות לפני ביצוע בדיקת הזוהר.

לאחר חישוב אחוזי העיכוב, פתח את תוכנת הניתוח וצור טבלת XY להתוויה. הגדר את ציר ה- y להזנת שלושה ערכי שכפול בעמודות משנה זו לצד זו. הדבק את הנתונים בטבלה כאשר x מייצג את ריכוז התרכובת ו- y מייצג אחוזי עיכוב.

כעת, לחץ על נתח. בחר רגרסיה לא ליניארית, התאמת עקומה, ולאחר מכן בחר עקומות תגובת מינון, עיכוב, ולאחר מכן מעכב לעומת תגובה מנורמלת, שיפוע משתנה ולחץ על אישור. הצג את עקומת תגובת המינון בחלונית השמאלית והחל התאמות אישיות, כגון שינויי צבע או פורמט נקודה.

אתר את טבלת ההתאמה הלא ליניארית כדי למצוא את מרווח הסמך המחושב IC50 ו- 95%. פירימידין אזפין 90 הראה עיכוב ברור תלוי ריכוז של פעילות המטרה עם עיכוב של יותר מ-95% שנצפה בריכוזים מ-0.125 למיקרו-מולר אחד, ואובדן מוחלט של פעילות מתחת ל-0.007 מיקרומולר, מה שמרמז על אפקט סף חד בתגובתו המעכבת. עקומת התגובה למינון שהותאמה לנתוני הפירימידין אזפין 90 הניבה ערך IC50 של 0.013 מיקרומולר, מה שמצביע על עוצמה גבוהה בעיכוב הפעילות הממוקדת.