Name: Ookluc: קו פלסמודיום ברגהיי לזיהוי תרכובות חוסמות שידור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: למד זיהוי תרכובות חוסמות שידור במלריה באמצעות קו Plasmodium berghei טרנסגני עם זיהוי לומינסנציה אוטומטי. שיטה זו מאפשרת סינון בקצב גבוה וקביעת IC50 מדויקת לפיתוח תרופות חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות האתיות ואושרו על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים של המכון למדעים ביו-רפואיים באוניברסיטת סאו פאולו (CEUA-ICB/USP). בעלי החיים שוכנו ותוחזקו בהתאם לסטנדרטים שנקבעו על ידי ועדה זו. ניסויים שכללו טפילי פלסמודיום מהונדסים גנטית, כמו גם אחסונם בהקפאה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, נערכו בהתאם לתקנות שנקבעו על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית של המכון למדעים ביו-רפואיים, אוניברסיטת סאו פאולו (CIBio-ICB/USP). בסך הכל נעשה שימוש בשלוש עכברי BALB/c, בגילאי 3-5 שבועות, במחקר זה - שתיים נגועות ואחת לא נגועה.
1. חומרים וריאגנטים
<ol>
	<li>הכן את מדיום האוקינט על ידי השלמת RPMI 1640 עם 0.025 M HEPES, פניצילין-סטרפטומיצין-ניאומיצין (PSN), 50 מ"ג/ליטר היפוקסנטין ו-100 מיקרומטר חומצה קסנתורנית. התאם את ה-pH ל-8.3 8,16.</li>
	<li>הכן את פתרון העבודה לבדיקת הזוהר על ידי ערבוב נפח אחד של מצע עם 50 נפחים של מאגר הליזיס המסופק במערכת בדיקת הלוציפראז.</li>
	<li>הגדר חממה ל-21 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>
2. זיהום ואיסוף דם טפילי
<ol>
	<li>להדביק שתי עכברי BALB/c נקבות (בגילאי 4-6 שבועות) ב-150 מיקרוליטר של זן Ookluc השמור בהקפאה באמצעות הזרקה תוך-צפקית (IP) (יום 0). הערה: בפרוטוקול זה, אנו ממליצים להשתמש בעכברי BALB/c בשל זמינותם והשימוש הנרחב שלהם במתקנים לבעלי חיים. עם זאת, כל זן עכבר מסוג בר הרגיש לזיהום P. berghei ותומך בגמטוציטוגנזה צריך להיות מתאים לשימוש.</li>
	<li>החל מהיום השלישי, העריכו טפילים וגמטוציטמיה על ידי בדיקה מיקרוסקופית של מריחות דם מוכתמות בגימסה.</li>
	<li>כאשר טפילים וגמטוציטמיה מגיעים לכ-5% ו-0.5%, בהתאמה (בדרך כלל ביום הרביעי), אספו דם באמצעות ניקור לב באמצעות מזרקים שעברו הפרין ואספו את הדם משני העכברים הנגועים. הערה: למרות שזהו קו טרנסגני של P. berghei, פרופיל הצמיחה והגמטוציטמיה שלו דומים לאלה שנצפו בזן ANKA. בהקשר זה, שיעור הגמטוציטים ביחס לסך הטפילים נמוך פי 10 בערך. הערה: באופן אידיאלי, צלחת התרכובת (ראה להלן) מוכנה לפני איסוף הדם הטפיל, כך שהדם מוזרם לצלחת מיד לאחר האיסוף. אם יש לאסוף את דם העכבר בחדר אחר, או שלא ניתן להזרים אותו מיד לצלחת התרכובת מכל סיבה אחרת, יש לשמור את הדם שנאסף בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ-30 דקות.</li>
</ol>
3. בדיקת המרה - הקרנה בצלחות 96 בארות
הערה: כדי להבטיח תוצאות עקביות, יש לחזור על הניסוי כולו שלוש פעמים בימים שונים כדי לאשר את הממצאים.
<ol>
	<li>הכן את דגימות התרכובת באמצעות מדיום אוקינט כמדלל (ריכוז סופי של 10 מיקרומטר). יש לדלל את מלאי התרכובת ל-1 מ"מ ולהכין דגימות עבודה על ידי דילול מלאי ה-1 מ"מ 1:100 v:v ב-Ookinete Medium. לבדיקה אחת בשכפול, הכינו נפח סופי של 200 מיקרוליטר של דגימת עבודה.</li>
	<li>אם התרכובת מדוללת בממס שאינו מים, כלול דגימת בקרה המכילה את הממס המדולל במדיום אוקינט באותה פרופורציה כמו בדגימת הבדיקה כדי להבטיח שכל עיכוב שנצפה מיוחס לתרכובת ולא לממס. הערה: כדוגמה, נסנן 90 תרכובות.</li>
	<li>בעזרת שתי צלחות של 96 בארות, הניחו 80 מיקרוליטר מהדגימות בכל באר, כדלקמן ומודגם באיור 1, בשכפול (שתי לוחות): בקרה חיובית: 80 מיקרוליטר של מדיום אוקינט; שליטה שלילית: 80 מיקרוליטר של מדיום אוקינט; בקרת ממס: 80 מיקרוליטר של מדיום אוקינט עם 1% DMSO; דגימות: 80 מיקרוליטר של 10 מיקרומטר מכל תרכובת במדיום אוקינט.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig1.jpg"> 
איור 1: ייצוג סכמטי של פריסת לוחות של 96 בארות המתוכננת עבור סינון מורכב. פריסת הלוחות כוללת בקרה חיובית (C+), בקרה שלילית (C-), בקרה בתוספת ממס דילול (C+S) ו-90 תרכובות בדיקה (S1-S90). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol start="4">
	<li>הוסף 4 מיקרוליטר של דם עכבר טפיל לכל באר של צלחת 96 הבארות ביחס של 1:20 v:v, למעט הבקרה השלילית (C-). הומוגניזציה עדינה על ידי פיפטינג. הערה: בהתחשב בהפסדים, אנו מחשבים את הצורך של ~400 מיקרוליטר של דם טפילי עבור כל צלחת.</li>
	<li>לבקרה השלילית, הוסף דם עכבר לא נגוע ביחס של 1:20 (v:v, דם:דגימה). הומוגניזציה עדינה.</li>
	<li>דגירה בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות או 24 שעות. הערה: פעילות nLuc ניתנת לזיהוי עם 6 שעות דגירה ומגיעה לשיאה ב-24 שעות של הבדיקה8. הבדיקה אינה מסוגלת לזהות תרכובות בעלות פעילות לאחר היווצרות זיגוטה, כמו תרכובות המעכבות מורפוגנזה של אוקינטים, מכיוון שזיגוטות שנוצרו יצברו nLuc ללא קשר להשלמת המורפוגנזה. לכן, דגירה של 6 שעות מספיקה כדי לזהות את כל התרכובות שיחסמו את פעילות ה-nLuc על ידי עיכוב גמטוגנזה, רקומבינציה מינית, או שיש להן ציטוטוקסיות מוקדמת. עם זאת, בדרך כלל אנו מעדיפים דגירה של 24 שעות כדי לקבל אותות חזקים יותר ויחס אות לרעש טוב יותר.</li>
</ol>
4. בדיקת זוהר
<ol>
	<li>לאחר תקופת הדגירה, הומוגניזציה של דגימות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כדי להבטיח ערבוב יסודי של מדיום הדם.</li>
	<li>הכן את תערובת מאגר הליזיס/מצע לוציפראז מיד לפני השימוש ביחס של 1:50 (v:v, מצע: מאגר ליזה).</li>
	<li>מערבבים את תערובת המצע עם דגימות ביחס של 1:1 (v:v), ומבטיחים ערבוב עדין כדי למנוע בועות. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות. הערה: בדוגמה זו, הוספנו 84 מיקרוליטר של מאגר מצע:ליזה לכל באר.</li>
	<li>מעבירים דגימות לצלחת לבנה עם תחתית שטוחה עם 96 בארות. מדוד זוהר באמצעות קורא צלחות. השתמש בתצורת הפרמטרים הבאה: מסנן פליטה: עדשה; זמן מרווח מדידה: 1 שניות לבאר.</li>
</ol>
5. ניתוח נתונים - סינון
<ol>
	<li>לאחר בדיקת הזוהר, רשמו את הנתונים הגולמיים שמופיעים (איור 2). הערה: יחידות האור היחסיות (RLU) המתקבלות תלויות בלומינומטר המשמש. במקרה שלנו, ערכי RLU עבור הבקרה החיובית נעו בין 10,000 ל-500,000 בבדיקת דגירה של 24 שעות. זמני דגירה קצרים יותר (6 שעות) יביאו לערכי RLU נמוכים יותר.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig2.jpg"> 
איור 2: תוצאות שהתקבלו מקריאה מדומה של בדיקת המרה לבדיקת תרכובות. התמונה מציגה קריאות זוהר מדומות מבדיקה שבוצעה לאחר המרה של אוקינטים בנוכחות פאנל של 90 תרכובות. ערכי יחידת אור יחסית נמוכים יותר מצביעים על היווצרות אוקינטים מופחתת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol start="2">
	<li>באמצעות גיליון אלקטרוני, חשב את הממוצע של כל מדידה באמצעות הנוסחה שלהלן. החלף את XX בכתובת של תא המדידה הראשון ואת YY בכתובת של תא המדידה השני. חזור על הנוסחה עבור כל הדוגמאות. =(ממוצע(XX:YY)</li>
	<li>המר את הנתונים ל-% עיכוב לניתוח טוב יותר של התוצאות. בגיליון האלקטרוני, השתמש בנוסחה הבאה. החלף את A בערך RLU לדוגמה ואת B בערך RLU הבקרה. חזור על הנוסחה עבור כל התרכובות שנבדקו: = 1 - (A/B) x 100 הערה: הנתונים יופיעו כפי שמוצג באיור 3.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig3.jpg"> 
איור 3: תוצאות שהתקבלו מקריאה מדומה של בדיקת המרה לבדיקת תרכובות מיוצגות כאחוז העיכוב עבור כל תרכובת. אחוז עיכוב ההמרה עבור כל תרכובת שנבדקה, מחושב כמתואר לעיל. הריבועים המודגשים מצביעים על תרכובות המקדמות יותר מ-95% עיכוב המרה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol start="4">
	<li>זהה את התרכובות המציגות יותר מ-95% עיכוב. הערה: תרכובות אלו מציגות פעילות גבוהה כנגד שלבי מין בריכוז של 10 מיקרומטר. בדוגמה שלנו, מצאנו חמש תרכובות עם פעילות גבוהה כנגד שלבים מיניים.</li>
	<li>עבור התרכובות שזוהו, בצע קביעת IC50 כמתואר להלן.</li>
</ol>
6. בדיקת המרה - קביעת IC 50
<ol>
	<li>להדביק עכברים ב-Ookluc ולאסוף דם טפיל, כמתואר בסעיף 2.</li>
	<li>הכן את הדגימות באמצעות מדיום אוקינט כמדלל. השתמש בריכוז ראשוני בו נצפתה עיכוב של 100% של המרה על ידי התרכובת. הערה: מכיוון שהתרכובות הפעילות זוהו במסך עם ריכוז של 10 מיקרומטר, אנו משתמשים ב-20 מיקרומטר כריכוז ההתחלתי עבור עקומת המינון-תגובה הראשונה. לעקומת מינון-תגובה מדויקת, חשוב שהבדיקה שלך תכלול ריכוזים ראשוניים המביאים לעיכוב של 100% של המרה וריכוזים סופיים המובילים לעיכוב של 0%. גישה זו מבטיחה חישוב IC50 מדויק. עקומת המינון-תגובה הראשונה תודיע על הריכוזים הנמוכים ביותר של התרכובת עם עיכוב ~100%. בפרוטוקול זה נשתמש ב- PyAz90, שזוהה לאחרונה באמצעות Ookluc13, כדוגמה.</li>
	<li>בצלחת של 96 בארות, הוסף משולש (ראה איור 4): בקרה חיובית (C+): 80 מיקרוליטר של מדיום אוקינט; בקרה שלילית (C-): 80 מיקרוליטר של מדיום אוקינט; דילול ראשון לדוגמא (Cpd D1): 160 מיקרוליטר של תרכובת בריכוז ראשוני במדיום אוקינט המביא לעיכוב של 100% של ההמרה; בארות D2 עד D12: 80 מיקרוליטר של מדיום אוקינט.</li>
	<li>בצע דילול סדרתי כפול על ידי פיפטינג של 80 מיקרוליטר של באר D1 לתוך D2, הומוגניזציה, ופיפטה 80 מיקרוליטר של באר D2 לתוך D3 וכן הלאה. ודא שלכל הבארות יש 80 מיקרוליטר של נפח כולל, לכן השלך את 80 המיקרוליטר האחרונים שהוסרו מהבאר D12. הערה: בצע את הניסוי עם לפחות שלושה שכפולים עבור כל הדגימות, כפי שמצוין באיור 4. כדי להבטיח את האמינות והשחזור של התוצאות שלך, יש לחזור על הניסוי כולו בשלושה ימים נפרדים תוך שימוש בבעלי חיים שנדבקו לאחרונה בכל פעם. הערה: אם במסך הראשון, התוצאות אינן מראות השפעה של הממס בהמרה, אין צורך לכלול בקרות אלה בדילולים סדרתיים. אחרת, יש לכלול גם דילולים סדרתיים של הממס.</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig4.jpg"> 
איור 4: פריסת לוחות 96 בארות המתוכננת עבור קביעת תרכובת IC50 . פריסת הלוחות כוללת דילול בקרה חיובית (C+), בקרה שלילית (C-) ודילול מורכב (Cpd) (D1 עד D12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol start="5">
	<li>הוסף דם עכבר טפיל לצלחת 96 הבארות ב-1:20 v:v. הומוגניזציה עדינה על ידי פיפטינג. הערה: בסך הכל יתווספו 4 מיקרוליטר של דם טפילי לכל באר, למעט לבקרה השלילית (C-). בהתחשב בהפסדים, אנו מחשבים את הצורך של ~200 מיקרוליטר של דם טפילי עבור כל תרכובת שתיבדק.</li>
	<li>בבארות בקרה שליליות, הוסף דם עכבר לא נגוע ביחס של 1:20 (v:v, דם:דגימה). הומוגניזציה עדינה.</li>
	<li>דגירה בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות או 24 שעות.</li>
	<li>בצע את בדיקת הזוהר, כמתואר בסעיף 4.</li>
</ol>
7. ניתוח נתונים - קביעת IC 50
הערה: IC50 מוגדר כריכוז של תרכובת הנדרשת לעיכוב 50% מהפעילות/עיכוב הביולוגי. בבדיקה זו, עיכוב מתייחס להפחתה בהמרת אוקינט. הנתונים מיוצגים כעקומת מינון-תגובה סיגמואידית, כאשר ציר ה-X מייצג ריכוז תרכובות (טרנספורמציה לוג) וציר ה-Y מייצג % עיכוב.
<ol>
	<li>חשב % עיכוב כמתואר בסעיף 5, שלב 5.3.</li>
	<li>פתח את התוכנה וצור טבלת XY.</li>
	<li>הגדר אפשרויות ציר Y ל - הזן 3 ערכי שכפול בעמודות משנה זו לצד זו.</li>
	<li>הדבק נתונים, כאשר X מייצג את ריכוז התרכובות ו-Y מייצג % עיכוב (איור 5A).</li>
	<li>בשורת התפריטים, לחץ על ניתוח ובחר רגרסיה לא ליניארית (התאמת עקומה) ולאחר מכן עקומות מינון-תגובה - עיכוב ו [מעכב] לעומת תגובה מנורמלת - שיפוע משתנה; לחץ על אישור.</li>
	<li>בחלונית השמאלית, התבונן בעקומת המינון-תגובה של הנתונים. החל את ההתאמה האישית הרצויה, כגון שינויי צבע ופורמטים של נקודות.</li>
	<li>אתר את טבלת ההתאמה של Nonlin כדי למצוא את ה-ICהמחושב 50 ו-95% רווח בר-סמך (95% CI) (איור 5B).</li>
</ol>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig5.jpg"> 
איור 5: עקומת מינון-תגובה של PyAz90. אחוז העיכוב נמדד כפונקציה של ריכוז PyAz90 (מיקרומטר) בסולם לוגריתמי. העקומה הסיגמואידית מייצגת את הנתונים המותאמים ששימשו לקביעת ה-IC50, שהיה 0.013 מיקרומטר (רווח בר-סמך 95%: 0.012-0.014 מיקרומטר). נקודות נתונים מייצגות את הממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע משכפולים ניסיוניים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<ol><li>World malaria report 2024: addressing inequity in the global malaria response. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024">https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024</a> (2025).</li>
<li>Miller, L. H., Ackerman, H. C., Su, X., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+biology+and+disease+pathogenesis%3A+insights+for+new+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Malaria biology and disease pathogenesis: insights for new treatments.</a> Nature Med. 19 (2), 156-167 (2013).</li>
<li>Tsoumani, M. E., Voyiatzaki, C., Efstathiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+Vaccines%3A+From+the+Past+towards+the+mRNA+Vaccine+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Malaria Vaccines: From the Past towards the mRNA Vaccine Era.</a> Vaccines. 11 (9), 1452(2023).</li>
<li>Ménard, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+under+the+skin%3A+the+first+steps+in+malarial+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Looking under the skin: the first steps in malarial infection and immunity.</a> Nature Rev. Microbiol. 11 (10), 701-712 (2013).</li>
<li>Appetecchia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission-blocking+strategies+for+malaria+eradication%3A+Recent+advances+in+small-molecule+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Transmission-blocking strategies for malaria eradication: Recent advances in small-molecule drug development.</a> Pharmaceuticals. 17 (7), 962(2024).</li>
<li>Baniecki, M. L., Wirth, D. F., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Plasmodium+falciparum+growth+assay+for+malaria+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput Plasmodium falciparum growth assay for malaria drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (2), 716-723 (2007).</li>
<li>Delves, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activities+of+current+antimalarial+drugs+on+the+life+cycle+stages+of+Plasmodium%3A+A+comparative+study+with+human+and+rodent+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">The activities of current antimalarial drugs on the life cycle stages of Plasmodium: A comparative study with human and rodent parasites.</a> PLoS Med. 9 (2), e1001169(2012).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+the+pathogen+box+for+molecules+active+against+Plasmodium+sexual+stages+using+a+new+nanoluciferase-based+transgenic+line+of+P.+berghei+identifies+transmission-blocking+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Screening the pathogen box for molecules active against Plasmodium sexual stages using a new nanoluciferase-based transgenic line of P. berghei identifies transmission-blocking compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 62 (11), e01053-e01118 (2018).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+transmission-blocking+antimalarials+identified+by+high-throughput+screening+of+Plasmodium+berghei+Ookluc%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Novel transmission-blocking antimalarials identified by high-throughput screening of Plasmodium berghei Ookluc.</a> Antimicrob Agents Chemother. 67 (4), e0146522(2023).</li>
<li>Lima, M. N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+multi-kinase+approach+for+the+identification+of+potent+antiplasmodial+hits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Integrative multi-kinase approach for the identification of potent antiplasmodial hits.</a> Front Chem. 7, 773(2019).</li>
<li>Ferreira, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+chemogenomics+drug+repositioning+strategy+enables+the+discovery+of+epirubicin+as+a+new+repurposed+hit+for+Plasmodium+falciparum%C3%82%C2%A0and%C3%82%C2%A0P.+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Computational chemogenomics drug repositioning strategy enables the discovery of epirubicin as a new repurposed hit for Plasmodium falciparumÂ andÂ P. vivax.</a> Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), aac.02041-aac.02119 (2020).</li>
<li>Krishnan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torin+2+derivative%2C+NCATS-SM3710%2C+has+potent+multistage+antimalarial+activity+through+inhibition+of+P.+falciparum+phosphatidylinositol+4-kinase+%28Pf+ACS+Pharmacol%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Torin 2 derivative, NCATS-SM3710, has potent multistage antimalarial activity through inhibition of P. falciparum phosphatidylinositol 4-kinase (Pf ACS Pharmacol).</a> Transl Sci. 3 (5), 948-964 (2020).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+azepine+targets+the+Plasmodium+bc1+complex+and+displays+multistage+antimalarial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22JACS+Au%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine azepine targets the Plasmodium bc1 complex and displays multistage antimalarial activity.</a> JACS Au. 4 (10), 3942-3952 (2024).</li>
<li>Lima, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalcones+as+a+basis+for+computer-aided+drug+design%3A+Innovative+approaches+to+tackle+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Chalcones as a basis for computer-aided drug design: Innovative approaches to tackle malaria.</a> Future Med Chem. 11 (20), 2635-2646 (2019).</li>
<li>Ferreira, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+4-aminoquinoline+chemotype+with+multistage+antimalarial+activity+and+lack+of+cross-resistance+with+PfCRT+and+PfMDR1+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A novel 4-aminoquinoline chemotype with multistage antimalarial activity and lack of cross-resistance with PfCRT and PfMDR1 mutants.</a> PLoS Pathog. 20 (10), e1012627(2024).</li>
<li>Blagborough, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+transmission+blockade+in+Plasmodium+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing transmission blockade in Plasmodium spp.</a> Methods Mol Biol. 923, 577-600 (2013).</li>
<li>Azevedo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+method+for+in+vitro+screening+of+Plasmodium+transmission-blocking+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (6), aac.02699-aac.02616 (2017).</li>
<li>Gaitán, X. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+merozoite+thrombospondin+related+anonymous+protein+%28MTRAP%29+of+Plasmodium+berghei+as+a+transmission-blocking+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the merozoite thrombospondin related anonymous protein (MTRAP) of Plasmodium berghei as a transmission-blocking antigen.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. , 119(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism גרסה 10.0.0 עבור Windows</td><td></td><td></td><td>תוכנת GraphPad, בוסטון, מסצ'וסטס, ארה"ב</td></tr><tr><td>מלח נתרן הפרין מרירית מעי חזיר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 מ')</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>היפוקסנטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>עכברים</td><td>---</td><td>---</td><td>נקבות עכברי BALB/c, בגילאי 3 עד 5 שבועות</td></tr><tr><td>מערכת בדיקת ננו-גלו לוציפראז</td><td>פרומגה</td><td>N1110</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין ומינוס; סטרפטומיצין ומינוס; תמיסת ניאומיצין מיוצבת</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>עמ' 4083</td><td></td></tr><tr><td>POLARStar קורא אומגה מיקרופלייט&nbsp;</td><td>ב.מ.ג. לאבטק</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני, תוסף GlutaMAX</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>61870036</td><td></td></tr><tr><td>חומצה קסנתורנית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D120804</td><td></td></tr></tbody></table>

ookluc: קו פלסמודיום ברגהיי לזיהוי תרכובות חוסמות שידור

Ookluc: A Plasmodium berghei Line for Identifying Transmission-blocking Compounds

Ookluc: קו פלסמודיום ברגהיי לזיהוי תרכובות חוסמות שידור

Malaria remains a world health challenge; in 2023, 263 million cases and 597,000 deaths were reported around the globe. The parasite's life cycle is ...

ookluc-plasmodium-berghei-line-for-identifying-transmission-blocking

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ברגע גן מזוהה עקשן פוטנציאלי עבור מלריה, זה חייב להיות מוערך על תפקידה במניעת זיהומים Plasmodium בתוך היתוש. פרוטוקול זה מדגים כיצד מידת זיהומים Plasmodium של יתושים יכול להיות assayed. טכניקות להכנת תרבות gametocyte, האכלה קרום יתושים דם האדם, assaying titers ויראלי midgut היתושים הם הפגינו.

פרוטוקול זיהומים Plasmodium falciparum בקביעת הפנוטיפ יתושים זיהום

מיקרו-רנ"א אנושי עובר מאריתרוציטים מאריח לטפילי פלסמודיום פלציפרום. כאן מתוארות הטכניקות המשמשות להעברת מיקרו-רנ"א סינתטיים לאריתרוציטים מארחים ולבידוד כל ה-RNA מ-P. falciparum.  בנוסף, מאמר זה יפרט שיטה לבידוד פוליזומים ב-P. falciparum כדי לקבוע את התפוסה הריבוזומלית ואת פוטנציאל התרגום של תעתיקי טפילים.

שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em

אנו מתארים מודל עכבר של מלריה מוחית ניסיונית ומראים כיצד ניתן לעקוב אחר פתולוגיה דלקתית ומיקרו-וסקולרית in vivo באמצעות הדמיית תהודה מגנטית.

בשנת מעקב Vivo של בצקת פיתוח ופתולוגיה מיקרוסקולרית במודל של מלריה מוחית ניסיוני באמצעות תהודה מגנטית הדמיה

בשל הדמיון הבולט של מחזור החיים ביולוגיה של טפילים מלריה מכרסמים לטפילים מלריה אדם, מודלים מלריה מכרסם הפכו חיוניים למחקר מלריה. בזאת, אנו מתוקננת כמה מן הטכניקות החשובות ביותר בשימוש בניתוח פנוטיפ של פראי סוג ומלריה מכרסם הטרנסגניים.

ניתוח פנוטימית של מלריה מכרסם טפיל מינית ושלבי דם מיניים ושלבי יתוש

חקירות מפורטות על שלבי יתושים של טפילי מלריה הם קריטיים לתכנון אסטרטגיות חסימת שידור יעילות. פרוטוקול זה מדגים כיצד לתרבות ביעילות gametocytes זיהומיות ולאחר מכן להאכיל את המשחקים האלה יתושים כדי ליצור שלבי יתושים של P. falciparum.

פלסמודיום פאלציפארום תרבות המשחק וזיהום יתושים באמצעות האכלה מלאכותית של ממברנה

שימוש בכרסום קרן יונים ממוקדת כדי לייצר זגוגית על הרשת מדגימות ביולוגיות קפואות עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונית.

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

פרוטוקול זה מתאר בדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים סנדוויץ' כדי לזהות ספורוזואיטים של בלוטת הרוק ביתושים. באמצעות נוגדנים חד-שבטיים הזמינים בקלות, השיטה מאפשרת זיהוי חסכוני ובתפוקה גבוהה של יתושים הנושאים פלסמודיום פלציפרום או פלסמודיום ויוואקס. השיטה מתאימה לחקר העברת מלריה, כולל סקרים וקטוריים.

איתור פלסמודיום ספורוזואיטים ביתושי אנופלס באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים

בדיקת הזנת הממברנה הסטנדרטית (SMFA) נחשבת לתקן הזהב להערכה וזיהוי של תרכובות פוטנציאליות נגד מלריה. מערכת האכלה מלאכותית זו משמשת להדבקת יתושים כדי להעריך עוד יותר את ההשפעות של תרכובות כאלה על העוצמה והשכיחות של טפיל פלסמודיום falciparum .

בדיקת הזנת ממברנה סטנדרטית לזיהוי זיהום פלסמודיום פלציפרום בווקטורים של יתושים אנופלס

כאן אנו מתארים שיטה חדשה כדי לעזור להבהיר את מנגנוני החסינות התאית פלסמודיום בשלב הדם של זיהום. זוהי בדיקת מבחנה המודדת הרג תאי דם אדומים נגועים על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים.

במבחנה בדיקה של הרג תאי דם אדומים נגועים בפלסמודיום על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים

מלריה מועברת באמצעות חיסון של שלב sporozoite של פלסמודיום על ידי יתושים נגועים. פלסמודיום מהונדס איפשר לנו להבין טוב יותר את הביולוגיה של המלריה ותרם ישירות למאמצי פיתוח החיסון למלריה. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה יעילה ליצירת פלסמודיום ברגהיי sporozoites מהונדס.

יצירת פלסמודיום מהונדס גנטית ברגהיי ספורוזואיטים

גנטיקה כימית כוללת החלפה של שאריות שוער בחומצת אמינו המכילה שרשרת צדדית שונה במוקד המטרה. כאן, יצרנו טפיל מוטנטי המכיל אלל היפומורפי של cdpk1 וזיהינו מסלולי פיצוי שאומצו על ידי הטפיל ברקע המוטנטי.

הבנת התפתחותם של מסלולי פיצוי בטפיל מלריה מוטנטי בעל אלל היפומורפי של קינאזות דמויות צמחים

למד זיהוי תרכובות חוסמות שידור במלריה באמצעות קו Plasmodium berghei טרנסגני עם זיהוי לומינסנציה אוטומטי. שיטה זו מאפשרת סינון בקצב גבוה וקביעת IC50 מדויקת לפיתוח תרופות חדשות.

Ookluc: קו פלסמודיום ברגהיי לזיהוי תרכובות חוסמות שידור

גלה סרטונים נוספים