Name: דיסקציה ודיסוציאציה מהירה של אפיתל הריח של העכבר למתלים חד-גרעיניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: למד פרוטוקול לדיסקציה מהירה של אפיתל הריח בעכבר לצורך ריצוף RNA של גרעינים בודדים. השיטה מאפשרת בידוד איכותי של גרעינים לחקר מגוון תאי מערכת הריח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

כל הניסויים בבעלי חיים במחקר זה אושרו ונערכו בהתאם ל-IACUC של מכללת ביילור לרפואה. נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J נקבות (JAX:000664). פרטי הריאגנטים והציוד מפורטים בטבלת החומרים.
1. דיסקציה של אפיתל הריח
<ol>
	<li>התחל בהרדמה עמוקה של העכבר בכל שיטה מועדפת (בהתאם לפרוטוקולים המאושרים על ידי המוסד). אשר את מישור ההרדמה הכירורגי על ידי צביטה יציבה בבוהן והמשך בזלוף טרנס-לבבי של לפחות 10 מ"ל של PBS 1x קר כקרח. הסר את העור כדי לחשוף את הגולגולת (איור 2A). הערה: הסרת הראש מהגוף היא אופציונלית. אם מחליטים להסיר את הראש, מומלץ להסיר את העור ורקמות רכות אחרות סביב הגולגולת לפני עריפת הראש.</li>
	<li>בעזרת זוג מספריים עדינים עם קצה חד, בצעו שני חתכים כדי לשבור את הקשתות הזיגומטיות מעצם הקשקש באופן דו-צדדי על ידי הצבת קצה מספריים אחד במסלול האחורי והשני צמוד לתעלת השמע (קווים ירוקים באיור 2B).</li>
	<li>בצע חתך רדוד ממסלול למסלול לאורך ההיבט הקדמי ביותר של העצם הקדמית. חתכו רק את פני השטח הגביים של העצם הקדמית (~1-2 מ"מ עומק), והקפידו לא לחתוך מבנים או עצמות שמרכיבים את המסלול (קו כחול באיור 2B). הערה: כדי להשיג חתך רדוד בין המסלולים, החזק את המספריים בניצב לגולגולת והשתמש רק בקצוות החדים כדי לחתוך.</li>
	<li>חותכים לאורך קו האמצע של הגולגולת מהפורמן מגנום, דרך התפרים הסגיטלי והבין-מצחי, עד שמגיעים לחתך הבין-אורביטלי שנעשה בעצם הקדמית בשלב 1.3 (קו אדום באיור 2B).</li>
	<li>הכנס זוג מלקחיים לחתך שנעשה לאורך קו האמצע של הגולגולת ומשוך בחוזקה חצי כדור אחד של קמרון הגולגולת לרוחב. פעולה זו גם תסיר את עצמות המסלול (קדמית, מקסילרית ודמעות), ותחשוף את ההיבטים הצדדיים של טורבינות הריח (איור 2D). הערה: הקפד לא לפגוע בשוגג ב-OE מנקודה זו ואילך.</li>
	<li>החזק את עצם האף והשיניים החותכות, שבור את קמרון הגולגולת הנגדי באמצעות מלקחיים. אפשרו למוח (כולל פקעות הריח) להיות מוסרים עם חצי הכדור של העצם כשהוא נתלש (איור 1E). המבנים הגרמיים היחידים הנראים לעין שאמורים להישאר אחרי השלב הזה הם בסיס הגולגולת והעצמות שמקיפות את ה-OE (איור 2F).</li>
	<li>בעזרת זוג ציפורני עצם או רונג'ורים, הסר את כל העצם הקדמית שנותרה והעצם הקדם-לסתית (החותכת) עד לבסיס השיניים החותכות (איור 2G).</li>
	<li>השתמש בציפורני עצם כדי לחתוך לאורך התפר הפרונטונזאלי כדי לשחרר את עצם האף מהצלחת הקריבריפורמית, תוך נקיטת זהירות יתרה לא לפגוע ב-OE החשוף הבסיסי או לשבור את הצלחת הקריבריפורמית.</li>
	<li>הרם את עצם האף מהצלחת הקריבריפורמית באמצעות מלקחיים כדי לחשוף את ה-OE (איור 2H). אם שאריות עצם קדם-לסתית מסתירות את ה-OE הגבי, הסר אותה לפני שתמשיך (עיגולים שחורים באיור 1I).</li>
	<li>בעזרת מלקחיים בעלי קצה עדין, אבטח בעדינות את ההיבט הגבי של מחיצת האף במפגש שלו עם הצלחת הקריבריפורמית ומשוך לאחור (איור 2J,K). עם התנגדות מינימלית, אפיתל הריח הראשי ישתחרר כמבנה שלם לחלוטין (איור 2L).</li>
	<li>המשך מיד עם דיסוציאציה של OE או הקפיא את הרקמה לעיבוד מאוחר יותר.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig2.jpg"> 
איור 2: טכניקה לדיסקציה מהירה של אפיתל הריח. (A) ראש העכבר אחרי הסרת הרקמה הרכה שמסביב. (B) מדריכים מקודדים בצבע לחתכים בקמרון הגולגולת. (ג) הופעה לאחר חתכים בקמרון הגולגולת. (ד) הסרת חצי הכדור הראשון של קמרון הגולגולת יחד עם חלק המסלול הסמוך לאפיתל הריח. (E) הסרת החלק הנגדי של קמרון הגולגולת יחד עם המוח. (F) הראש לאחר הסרת המוח וקמרון הגולגולת. (G) הסרת העצם הקדמית הקדמית ביותר והקדם-לסת האחורית, לאחר חתך בתפר הפרונטומקסילרי. (ח) הסרת עצמות האף. (I) עיגולים שחורים מדגישים אזורים של שאריות עצם קדם-לסתית שניתן להסיר באופן אופציונלי. (י) הצבת מלקחיים להסרת אפיתל הריח השלם. (K) משוך לאחור כדי לשחרר את אפיתל הריח. (L) שחרור מוחלט של אפיתל הריח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
2. דיסוציאציה של אפיתל הריח ובידוד גרעין יחיד
<ol>
	<li>הניחו צינור C אחד ושני צינורות חרוטיים של 15 מ"ל לדגימה על קרח.</li>
	<li>הכן מאגר ליזה על ידי הוספת מעכב RNAse (לריכוז סופי של 0.2 U/μL) למאגר מיצוי גרעינים מוכן מראש.</li>
	<li>הוסף 4 מ"ל של 1% BSA לכל צינור חרוטי של 15 מ"ל, מערבולת קצרה והשליך עודפים. זה מצפה כל אחד מהצינורות החרוטיים של 15 מ"ל ב-BSA כדי למזער את הידבקות הגרעינים לצינור.</li>
	<li>עבור OE שלם אחד, הוסף 2 מ"ל של מאגר ליזה קר כקרח לכל צינור C.</li>
	<li>הוסף דגימות OE לצינורות C. בעזרת מלקחיים #2, החזיקו כל דגימה מעל צינור ה-C המתאים לה וחתכו אותה לחתיכות קטנות בעזרת מספריים עדינים.</li>
	<li>הנח את צינורות ה-C המכילים כל דגימה הפוכה על גושי דיסוציאטור הרקמות האוטומטיים. במסך הניתוק, הריבוע המתאים לכל בלוק ישתנה מחופשי לנבחר.</li>
	<li>לחץ על סמל התיקיה כדי לעבור לתיקיית Miltenyi . בעזרת החצים, גלול לתוכנית 4C_nuclei_1 (תוכנית טעונה מראש בתוך המנתק). לחץ על אישור כדי להחיל את התוכנית על כל בלוק ולאחר מכן לחץ על התחל כדי להתחיל את המחזור. הסר את צינורות ה-C מהדיסוציאטור מיד לאחר השלמת המחזור. הערה: במידת האפשר, שמור על צינורות ה-C קרים כקרח במהלך מחזור הניתוק. חשוב להסיר את הדגימות מהדיסוציאטור מיד לאחר השלמת המחזור ולהמשיך בשלבים הבאים של הפרוטוקול כדי למנוע ליזיס יתר של הגרעינים.</li>
	<li>בעזרת פיפטה, שאפו את המתלה ההומוגני מצינור ה-C וסננו אותו דרך מסננת של 70 מיקרומטר לתוך הצינור החרוטי הראשון המצופה BSA. הימנע משאיבת שברי העצם שהצטברו בתחתית צינור ה-C.</li>
	<li>שטפו את המסננת עם 1 מ"ל PBS 1x קר כקרח כדי להבטיח סינון מלא.</li>
	<li>צנטריפוגה את המתלה המסונן ב-500 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה עם דלי מתנדנד.</li>
	<li>שאפו בעדינות והשליכו את הסופרנטנט, תוך הקפדה להימנע מהפרעה לכדור. השעו לחלוטין את גלולת הגרעינים ב-1 מ"ל של 1x PBS קר כקרח על ידי פיפטינג עדין.</li>
	<li>העבירו את הגרעינים התלויים דרך מסננת של 30 מיקרומטר לתוך הצינור החרוטי השני המצופה BSA. ניתן לכמת את ריכוז הגרעינים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.</li>
	<li>המשך מיד עם הפרוטוקול הנבחר במורד הזרם (עם או בלי FACS) כדי לשמור על שלמות הדגימה ולמנוע השפלה (איור 3). הערה: מומלץ מאוד למשתמשים לבצע ריצות תרגול של פרוטוקול זה כולו כדי להבטיח השלמה חלקה ובזמן.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig3.jpg"> 
איור 3: דיסוציאציה של אפיתל הריח וזרימת עבודה של בידוד גרעין יחיד. לאחר הדיסקציה, אפיתל הריח מפורק מכנית וכימית. לאחר מכן מסננים את הליזאט דרך מסננת של 70 מיקרומטר, שוטפים אותו ב-1x PBS ומצנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 5 דקות. הגלולה מושעה מחדש ב-1x PBS לפני שהיא מסוננת דרך מסננת של 30 מיקרומטר. תרחיף הגרעינים המתקבל זמין עבור יישומי ריצוף שונים במורד הזרם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<ol><li>Graziadei, P. P. C., Graziadei, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+and+neuron+regeneration+in+the+olfactory+system+of+mammals.+I.+Morphological+aspects+of+differentiation+and+structural+organization+of+the+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. I. Morphological aspects of differentiation and structural organization of the olfactory sensory neurons.</a> J Neurocytol. 8 (1), 1-18 (1979).</li>
<li>Monti Graziadei, G. A., Graziadei, P. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+and+neuron+regeneration+in+the+olfactory+system+of+mammals.+II.+Degeneration+and+reconstitution+of+the+olfactory+sensory+neurons+after+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. II. Degeneration and reconstitution of the olfactory sensory neurons after axotomy.</a> J Neurocytol. 8 (2), 197-213 (1979).</li>
<li>Caggiano, M., Kauer, J. S., Hunter, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globose+basal+cells+are+neuronal+progenitors+in+the+olfactory+epithelium%3A+a+lineage+analysis+using+a+replication-incompetent+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Globose basal cells are neuronal progenitors in the olfactory epithelium: a lineage analysis using a replication-incompetent retrovirus.</a> Neuron. 13 (2), 339-352 (1994).</li>
<li>Iwai, N., Zhou, Z., Roop, D. R., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+basal+cells+are+multipotent+progenitors+in+normal+and+injured+adult+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Horizontal basal cells are multipotent progenitors in normal and injured adult olfactory epithelium.</a> Stem Cells. 26 (5), 1298-1306 (2008).</li>
<li>Schwob, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cells+of+the+mammalian+olfactory+epithelium%3A+Taking+poietic+license%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cells of the mammalian olfactory epithelium: Taking poietic license.</a> J Comp Neurol. 525 (4), 1034-1054 (2017).</li>
<li>Fletcher, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+olfactory+stem+cell+trajectories+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Deconstructing olfactory stem cell trajectories at single-cell resolution.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 817-830.e8 (2017).</li>
<li>Gadye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+activates+transient+olfactory+stem+cell+states+with+diverse+lineage+capacities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Injury activates transient olfactory stem cell states with diverse lineage capacities.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 775-790.e9 (2017).</li>
<li>Saraiva, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+deconstruction+of+mouse+olfactory+sensory+neurons%3A+from+whole+mucosa+to+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Hierarchical deconstruction of mouse olfactory sensory neurons: from whole mucosa to single-cell RNA-seq.</a> Sci Rep. 5 (1), 18178(2015).</li>
<li>Fletcher, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+regulates+olfactory+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">p63 regulates olfactory stem cell self-renewal and differentiation.</a> Neuron. 72 (5), 748-759 (2011).</li>
<li>Brann, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neuronal+expression+of+SARS-CoV-2+entry+genes+in+the+olfactory+system+suggests+mechanisms+underlying+COVID-19-associated+anosmia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Non-neuronal expression of SARS-CoV-2 entry genes in the olfactory system suggests mechanisms underlying COVID-19-associated anosmia.</a> Sci Adv. 6 (31), eabc5801(2020).</li>
<li>Carter, L. A., MacDonald, J. L., Roskams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+horizontal+basal+cells+demonstrate+a+conserved+multipotent+progenitor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory horizontal basal cells demonstrate a conserved multipotent progenitor phenotype.</a> J Neurosci. 24 (25), 5670-5683 (2004).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Sci Rep. 7 (1), 6031(2017).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Ruiz Tejada Segura, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+transcriptomics+atlas+of+the+mouse+nose+sheds+light+on+the+anatomical+logic+of+smell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A 3D transcriptomics atlas of the mouse nose sheds light on the anatomical logic of smell.</a> Cell Rep. 38 (12), 110547(2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+census+of+mammalian+olfactory+epithelium+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic census of mammalian olfactory epithelium aging.</a> Dev Cell. 59 (22), 3043-3058.e8 (2024).</li>
<li>Dunston, D., Ashby, S., Krosnowski, K., Ogura, T., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+manual+deboning+method+to+prepare+intact+mouse+nasal+tissue+with+preserved+anatomical+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization.</a> J Vis Exp. (78), e50538(2013).</li>
<li>Gurumurthy, R. K., Kumar, N., Chumduri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+isolation+of+high-quality+single+cells+from+the+female+mouse+reproductive+tract+tissues+for+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for isolation of high-quality single cells from the female mouse reproductive tract tissues for single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100970(2021).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+RNA+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches.</a> Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).</li>
<li>Belfort, B. D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+AAV+serotypes+for+transduction+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of AAV serotypes for transduction of olfactory sensory neurons.</a> Front Neurosci. 19, 1531122(2025).</li>
<li>Huang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+olfactory+sensory+neurons+provide+behaviourally+relevant+sensory+input+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Immature olfactory sensory neurons provide behaviourally relevant sensory input to the olfactory bulb.</a> Nat Commun. 13 (1), 6194(2022).</li>
<li>Barrios, A. W., Nunez, G., Sanchez Quinteiro, P., Salazar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy%2C+histochemistry%2C+and+immunohistochemistry+of+the+olfactory+subsystems+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Anatomy, histochemistry, and immunohistochemistry of the olfactory subsystems in mice.</a> Front Neuroanat. 8, 63(2014).</li>
<li>Antunes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+nasal+septa+for+respiratory+epithelial+air-liquid+interface+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures.</a> Biotechniques. 43 (2), 195-204 (2007).</li>
<li>Wu, J., Cai, Y., Wu, X., Ying, Y., Tai, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Bakulski, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+the+gene+expression+effects+of+developmental+lead+%28Pb%29+exposure+on+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of the gene expression effects of developmental lead (Pb) exposure on the mouse hippocampus.</a> Toxicol Sci. 176 (2), 396-409 (2020).</li>
<li>Chang, C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+uncovers+the+individual+alteration+of+intestinal+mucosal+immunocytes+in+Dusp6+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing uncovers the individual alteration of intestinal mucosal immunocytes in Dusp6 knockout mice.</a> iScience. 25 (2), 103738(2022).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Koenitzer, J. R., Wu, H., Atkinson, J. J., Brody, S. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA-sequencing+profiling+of+mouse+lung.+Reduced+dissociation+bias+and+improved+rare+cell-type+detection+compared+with+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA-sequencing profiling of mouse lung. Reduced dissociation bias and improved rare cell-type detection compared with single-cell RNA sequencing.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 63 (6), 739-747 (2020).</li>
<li>Xiong, A., Zhang, J., Chen, Y., Zhang, Y., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+single-cell+transcriptomic+analyses+reveal+that+GPNMB-high+macrophages+promote+PN-MES+transition+and+impede+T+cell+activation+in+GBM%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM.</a> eBioMedicine. 83, 104239(2022).</li>
</ol>

אפיתל הריח של העכברים (OE) הוא מרכיב חיוני במערכת הריח ואחראי על איתור והתמרת אותות ריח למערכת העצבים המרכזית. השכבה השטחית ביותר שלו מכילה את הריסים המזהה ריחות של נוירוני חוש הריח, המכוסים בשכבת ריריות ומוקפים בתאי הסוסטנטקולרי והמיקרו-וילאר התומכים 1,2. OSNs הם דו קוטביים, מרחיבים את הריסים שלהם באופן אפיקלי ליצירת סריג בתוך שכבת הריר והאקסונים שלהם בבסיס דרך הצלחת הקריבריפורמית הגרמית כדי להתלכד לגלומרולי בתוך פקעת הריח. גלומרולים אלה הם האתר של סינפסות בין OSNs לנוירונים במורד הזרם. בבסיס OSNs, תאי אב עצביים הנקראים תאי בסיס כדוריים מחדשים כל הזמן OSNs כשהם מתים3 בעקבות חשיפה ישירה לעלבונות סביבתיים כמו רעלים הנישאים באוויר, פתוגנים וטראומה פיזית. תאי בסיס כדוריים נגזרים ממאגר מילואים של תאי בסיס אופקיים רב-פוטנטיים 4,5, הממוקמים באופן הבסיסי ביותר ונצמדים ללמינה הבסיסית של בליטות גרמיות הנקראות טורבינטות אף. טורבינות האף מפותלות, מה שהופך את ה-OE לקשה להפרדה והומוגניזציה. יתר על כן, ה-OE מוקף בעצמות הגולגולת, מה שמקשה על הגישה לאזור ודורש באופן מסורתי הליך עתיר זמן.
מחקרים קודמים הסתמכו על דגירה ממושכת של פפאין כדי לשחרר את אפיתל הריח מהעצם 6,7,8,9,10, מה שיכול לעכב עוד יותר את העיבוד במורד הזרם של התרחיף החד-תאי. מכיוון שגזירה של אקסוני OSN מעוררת אפופטוזיס11, מזעור משך הזמן מחילוץ רקמות להכנת ספריית cDNA הוא הכרחי. יתר על כן, הארכיטקטורה של ה-OE וההקרנות שלו לפקעת הריח מסבכות את מיצוי התאים השלמים לריצוף RNA מוצלח של תא בודד. למרבה המזל, ריצוף RNA חד-גרעיני (snRNA-seq) התגלה ככלי רב עוצמה ליצירת פרופיל תאים תוך שמירה על התפלגות סוג התא, במיוחד ברקמות שבהן דיסוציאציה של תא בודד קשה או לא מעשית12,13.
בעוד שמספר מחקרים 6,7,8,10,14,15 ביצעו ריצוף תאים בודדים של OE של העכבר, אף אחד מהם לא מציע הליך דיסקציה מפורט המותאם לאיסוף רקמות עקבי ויעיל, דבר הכרחי בהתחשב בשבריריות ה-OE והמעטפת על ידי עצמות שונות של הגולגולת. בנוסף, מדריכי דיסקציה קיימים16 מתמקדים בשימור המבנה האנטומי ולא במהירות, מה שמוביל לזמני דיסקציה ארוכים פוטנציאליים. מכיוון שהכנת רקמות יעילה חיונית כדי למזער את פירוק ה-RNA ולמקסם את איכות הגרעינים המוכנים17,18, יש צורך בפרוטוקול אופטימלי לניתוח מהיר והומוגניזציה של OE עכברי לתרחיף בעל גרעין יחיד לשימוש ביישומים שונים במורד הזרם.
פרוטוקול זה (איור 1) מציג שיטה יעילה שנועדה להתגבר על אתגרים אלה, ומאפשרת דיסקציה מהירה של OE העכברי ודיסוציאציה יעילה של הרקמה לצורך בידוד גרעינים. גישה זו מאפשרת ריצוף גרעין יחידבאיכות גבוהה 19, ומספקת טכניקה אמינה לחקירת היסודות המולקולריים של ביולוגיה של חוש הריח.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig1.jpg"> 
איור 1: אנטומיה של התפרים והעצמות הרלוונטיים של גולגולת עכבר C57BL/6 וחתך מייצג של אפיתל הריח. (A) התפרים של הגולגולת מקודדים בצבע. תפרים מקודדים בצבע בצד אחד של הגולגולת, בעוד שהצד השני נותר ללא סימון לעיון (משמאל). שמות התפרים מקודדים בצבע בהתאם (מימין). (B) עצמות הגולגולת מקודדות בצבע. העצמות מקודדות בצבע בצד אחד של הגולגולת, בעוד שהצד השני נותר לא מסומן לעיון (משמאל). שמות העצמות מקודדים בצבע בהתאם (מימין). (C) חתך רוחב של החלק המרכזי של ה-OE (מנותח בשיטה המתוארת במאמר זה) עם טורבינות מקודדות בצבע בצד אחד ובצד שמאל לא מסומן לעיון (משמאל). שמות הטורבינות החזותיות (מימין). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>צינור צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>סלטריט</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>ניפר עצם&nbsp;</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>16102-11</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיניאטוריות של איריס Bonn&nbsp;</td><td>מילקס&nbsp;</td><td>18-1392</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>א1595</td><td></td></tr><tr><td>דומונט #3 מלקחיים&nbsp;</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>עכברי C57BL/6J נקבה</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>ג'קס:000664</td><td></td></tr><tr><td>שפופרות C עדינות של MACS&nbsp;</td><td>מילטני ביוטק</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS אוקטו דיסוציאטור&nbsp;</td><td>מילטני ביוטק</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>מסננות MACS SmartStrainers 30 um&nbsp;</td><td>מילטני ביוטק</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers 70 um&nbsp;</td><td>מילטני ביוטק</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו פרידמן-פירסון רונג'רס</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>16220-14</td><td></td></tr><tr><td>מאגר מיצוי גרעינים&nbsp;</td><td>מילטני ביוטק</td><td>130-128-024</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח עם חומצת פוספט (PBS), 1x ללא סידן ומגנזיום, PH 7.4 ופלוסמן; 0.1</td><td>קורנינג</td><td>21-040-קורות חיים</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNAse מגן&nbsp;</td><td>מיליפור סיגמא</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת Sorvall Legend XTR</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>50119927-5</td><td></td></tr></tbody></table>

דיסקציה ודיסוציאציה מהירה של אפיתל הריח של העכבר למתלים חד-גרעיניים

Rapid Dissection and Dissociation of the Mouse Olfactory Epithelium for Single-Nucleus Suspensions

כדי לספק הקשר אנטומי לדיסקציה וניתוח, התפרים והעצמות של גולגולת העכבר C57BL/6, כמו גם החלק המרכזי של אפיתל הריח (OE), הודגמו וקודדו בצבע (איור 1). צד אחד של כל תמונה הוער כדי להדגיש תפרים, עצמות וטורבינות רלוונטיים, בעוד שהצד השני נותר לא מסומן לעיון. חתך ה-OE הוכן בהתאם לפרוטוקולים שנקבעו20, וזיהוי הטורבינות התבסס על אפיונים אנטומיים קודמים21.
בעוד שציטומטריית זרימה אינה חיונית לאחר בידוד גרעינים, נתונים מייצגים מצי...

The murine olfactory epithelium is the initial entry point of the olfactory system, housing various cell types that include olfactory sensory neurons, ...

rapid-dissection-dissociation-mouse-olfactory-epithelium-for-single

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Photolysis של תרכובות בכלוב מאפשר ייצור של עליות מהירה מקומי בריכוז של חומרים פעילים מבחינה פיזיולוגית שונים. כאן, אנו מראים כיצד ניתן להשיג תיקון-clamp הקלטות בשילוב עם photolysis המחנה בכלוב או בכלוב Ca לחקר התמרה חוש הריח של העכבר ניתק עצב ההרחה חושית.

פלאש Photolysis של תרכובות כלואה צילה של עצב סנסורי חוש הריח

הסרטון מדגים את הבידוד של נוירונים מוטוריים, טרוכליאריים ומוטוריים בעמוד השדרה מעובר עכבר מהונדס. העובר מבטא נוירונים מוטוריים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) להדמיה וזיהוי קלים. הנוירונים המוטוריים מבודדים בניתוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ונשמרים בתווך תרבית.

בידוד ותרבית של נוירונים אוקולומוטוריים, טרוכליאריים ומוטוריים בעמוד השדרה מעובר עכבר

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי אוליגודנדרוציטים ראשוניים מתרחיף תא עצבי המתקבל מגור עכבר באמצעות הפרדה מגנטית. הטכניקה עושה שימוש בחרוזים מגנטיים המצופים בנוגדנים ספציפיים לאנטיגנים אוליגודנדרוציטים, המאפשרים בידוד סלקטיבי של תאים אלה.

בידוד אוליגודנדרוציטים ראשוניים באמצעות חרוזים אימונומגנטיים

סרטון זה מדגים הקלטה אלקטרופיזיולוגית של נוירונים חושי ריח (OSNs) בעכברים באמצעות טכניקת מהדק טלאי מחורר. אפיתל הריח, המכיל OSN עם קולטני ריח מתויגים פלואורופור, מבודד מעכבר ומאובטח בתא הקלטה. פיפטת הקלטה מהודקת לידית הדנדריטית של OSN, וניסטטין בתוך הפיפטה מנקב את הממברנה כדי ליצור קישוריות חשמלית עם התא. לבסוף, פיפטה נוספת משמשת להעברת ממריץ ריח, והפעילות האלקטרופיזיולוגית של התא המתוקן נרשמת.

רישום טלאי מהדק מחורר של נוירונים חושי ריח בעכברים

ריסים של נוירונים חושי ריח מכילים חלבונים של מפל העברת האותות, אך ניתוח מרחבי מפורט של התפלגותם קשה בהקפאות. אנו מתארים כאן גישה אופטימלית לתיוג הר שלם והדמיה פנים של חלבונים ריסניים.

הר תיוג כל צילה במערכת חוש הריח העיקרית של עכברים

ניתוח התכונות הפיזיולוגיות של נוירונים חושי ריח עדיין מתמודד עם מגבלות טכניות. כאן אנו מתעדים אותם באמצעות מהדק טלאי מחורר בהכנה שלמה של אפיתל הריח בעכברים ממוקדי גנים. טכניקה זו מאפשרת לאפיין את תכונות הממברנה ותגובות לליגנדים ספציפיים של נוירונים המבטאים קולטני ריח מוגדרים.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

אוליגודנדרוציטים הם תאי המיאלין של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד ותרבית של קודמיהם, תאי אב אוליגודנדרוציטים, מקליפת חולדות, כמו גם שיטה כמותית מהירה ואמינה להערכת אוליגודנדרוגנזה במבחנה בתגובה לגורמים ניסיוניים.

הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום

אנו מתארים את הבידוד immunomagnetic של העכבר הראשי oligodendrocytes, המאפשרת בידוד מהיר ולא ספציפי של תאי במבחנה לתרבות.

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

מוצגת שיטה למיקרודיסקציה של oviduct העכבר המאפשרת איסוף של מקטעים בודדים תוך שמירה על שלמות RNA. בנוסף, הליך פירוק תאים oviductal לא אנזימטי מתואר. השיטות מתאימות לניתוח גנים וחלבון לאחר מכן של מקטעי oviductal שונים מבחינה תפקודית ותאי oviductal מנותקים.

ניתוח מיקרו-דיסקט וניתוק של אובידוקט מורין: זיהוי מקטע בודד ובידוד תא בודד

ההצלחה של תעתיק חד-תאי/חד-גרעיני ומולטי-אומיקה תלויה במידה רבה באיכות התאים/גרעינים. לכן, בידוד תאים/גרעינים מרקמה וטיהורם חייבים להיות סטנדרטיים ביותר. פרוטוקול זה מתאר את הכנת הגרעינים מהמוח וממח העצם לבדיקת מולטיום-גרעינים חד-גרעיניים במורד הזרם.

הכנה איכותית של גרעיני מוח ומח עצם לבדיקות מולטיום של גרעינים בודדים

למד פרוטוקול לדיסקציה מהירה של אפיתל הריח בעכבר לצורך ריצוף RNA של גרעינים בודדים. השיטה מאפשרת בידוד איכותי של גרעינים לחקר מגוון תאי מערכת הריח.

דיסקציה ודיסוציאציה מהירה של אפיתל הריח של העכבר למתלים חד-גרעיניים

גלה סרטונים נוספים