פרוטוקול מבוסס פלואורסצנציה לסינון ראשוני של מעכבי סינתזת חלבונים ממקורות טבעיים

פרוטוקול מבוסס פלואורסצנציה לסינון ראשוני של מעכבי סינתזת חלבונים ממקורות טבעיים. סינתזת חלבונים כוללת תהליכים מווסתים מאוד, שעתוק ותרגום. השעתוק מוסדר בעיקר על ידי גורמי שעתוק, שינויים בכרומטין ו-RNA רגולטורי.

בעוד שהתרגום מוסדר על ידי גורמי התחלה, מסלולי איתות ומנגנוני יציבות RNA. מערכות רגולציה אלו מאפשרות לתאים לשמור על תפקוד תאים ולהגיב ללחץ או נזק ביעילות. תאי הסרטן מפריעים לסינתזת חלבונים על ידי השתלטות על מנגנון תרגומי כדי לתמוך בדרישות האנרגיה הגבוהות שלהם ובצמיחה בלתי מבוקרת.

תכנות מחדש זה הוא תוצאה של חוסר ויסות כמעט בכל מסלולי האיתות האונקוגניים העיקריים, המקדם הישרדות, התרבות וגרורות של התאים תוך דיכוי מסלולי מוות תאים. מכיוון שסינתזת החלבון המוגברת הזו חיונית להישרדות סרטן, טיפולים שמכוונים וחוסמים תהליך זה מראים פוטנציאל לטיפולים. לזיהוי מעכבי סינתזת חלבונים, ניתן להשתמש במבחן הפלואורסצנציה הבא לעיכוב סינתזת חלבון.

לפני תחילת הניסוי, כדי לקבל תוצאות אמינות, יש לתת תרכובות בריכוז מתאים מתחת לסף הרעילות שלהן. כדי לקבוע ריכוז התחלתי, יש לבצע בדיקת ציטוטוקסיות כדי לקבוע את EC 50 של התרכובת. אם זה לא אפשרי, ניתן לבדוק תרכובות במבחן זה באופן תלוי במינון כדי לקבוע את פרמטרי הריכוז היעילים ביותר.

אם ריכוז התרכובת גורם למוות תאי, יש צורך בבדיקות בריכוזים נמוכים. חשוב גם להגן על הצבעים מפני אור בכל עת כאשר אינם בשימוש. חשיפה ממושכת לאור תגרום לפוטוליצ'ינג, מה שיוביל לירידה באיכות הנתונים.

שלב 3.1: הכינו תערובת ראשית A, סומנו צינור צנטריפוגה כ-A, ואז פיפטה 598.5 מיקרוליטר של מדיום תרבית, ו-1.5 מיקרוליטר של תווית חלבון לתוך A. החזירו את התערובת הזו כדי להבטיח הומוגניות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. כעת הכינו את תערובת המאסטר B. תייגו צינור צנטריפוגה כ-B, ואז הפיפטה של 1.5 מיקרוליטר של תווית חלבון, 6.6 מיקרוליטר ציקלוהקסימיד ו-591.9 מיקרוליטר של מדיום תרבית לתוך B. החזירו את התערובת הזו כדי להבטיח הומוגניות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר פיפטינג של מיקרוליטר אחד של תרכובת בדיקה ומיקרוליטר אחד של רכב לשני בארות, פיפט עדין של 99 מיקרוליטר של מאסטר מיקס A לשתי הבארות הללו, פיפטה בזווית לצד הבאר כדי למנוע הפרעה קינטית של התאים.

פיפטה 100 מיקרוליטר של מאסטר מיקס B לשני בארות לא מטופלות. פיפט בזווית לצד הבאר כדי למנוע הפרעה קינטית של התאים. הקישו בעדינות על הפלטה כדי להשיג שילוב יסודי של הרכיבים הרצויים בתוך התאים.

דגרו תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שעתיים. הסר את מדיום תרבית התאים באמצעות שאיבה. הטה את הלוח ושאוף לצד הבאר במקום במרכז כדי למנוע הפרעה קינטית של התאים.

לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של בופר PBS לכל באר וצנטריפוגות את הפלטה ב-900 גרם למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה, זכור להסיר את בופר ה-PBS באמצעות שאיבה. שלב חמישי, קיבוע וחדירה.

הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע לכל באר. לאחר מכן דגרו את התאים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות בסביבה חשוכה. אחר כך שאפו את התאים.

שטוף את התאים עם 100 מיקרוליטר של בופר שטיפה והסר באמצעות שאיבה. חזור על זה פעמיים. הוסיפו 100 מיקרוליטר של בופר חדירות לכל באר.

לאחר מכן, דגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הסר את בופר החדירות באמצעות שאיבה. שלב שישי, תגובת חלבון וצביעה.

הכינו את תערובת המאסטר של קוקטייל התגובה. הוסיפו 651 מיקרוליטר של בופר PBS לצינור צנטריפוגה. ואז הוסיפו שבעה מיקרוליטרים של 100x תגובת נחושת.

ואז שבעה מיקרוליטרים של אזיד פלואורסצנטי. ולבסוף, הוסיפו 35 מיקרוליטר של חומר מפחית לצינור הצנטריפוגה. עקבו אחרי הסדר המדויק הזה בעת הוספת המגבים, ואז הוסיפו 100 מיקרוליטר של קוקטייל התגובה לכל באר.

דגרו את התאים למשך 30 דקות בסביבה חשוכה בטמפרטורת החדר כדי למנוע הלבנת פוטו. צנטריפוגה את התאים ב-900 גרם למשך חמש דקות. שאוף, שטוף את התאים ואז שאפוף שוב.

הכינו דילול פי 1 של צבע ה-DNA הכולל והוסיפו 100 מיקרוליטר לכל באר. דגרו תאים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות בסביבה חשוכה כדי למנוע פוטובלינצ'ינג. צנטריפוגה את הצלחת ב-900 גרם למשך חמש דקות.

שטוף את התאים עם 100 מיקרוליטר של בופר שטיפה, הסר באמצעות שאיבה. חזור על השלב פעמיים. לבסוף, החזירו את התאים עם 100 מיקרוליטר של בופר PBS מקורר כדי להכין אותם להדמיה.

שלב שמונה, הדמיה. הכנס את הלוחית לקורא הלוחות והגדר את ההגדלה ל-20x. נתחו את צבע הגרעין עם ערוץ GFP 469/525 ננומטר.

השתמשו בכיפוף אוטומטי ומיקוד אוטומטי כדי לשפר את תוצאות ההדמיה. נתח סינתזת חלבונים פעילה עם ערוץ Texas Red 586/647 ננומטר. השתמשו בכיפוף אוטומטי ומיקוד אוטומטי כדי לשפר את תוצאות ההדמיה.

גשושי פלואורסצנטיים רגישים לפוטו-הלבנה, שהיא תופעה שבה קרינה עם אור גורמת לפלואורופורים לאבד את תכונותיהם הפלואורסצנטיות. יש להגן על צבעי הצבע מפני אור בכל עת כאשר אינם בשימוש. בנוסף, יש להגביל את מספר הסריקות בכל באר ובכל זמן תחת אור מואר.

חשיפה ממושכת לאור תוביל להלבנת פוטו, מה שמוביל בסופו של דבר לירידה באיכות הנתונים. בואו נבחן את התוצאות המייצגות. תאים חיים כאן נראים בירוק וסינתזת חלבון פעילה מסומנת באדום.

ציקלוהקסימיד ידוע של מעכב סינתזת חלבונים גורם לירידה משמעותית בסינתזת חלבונים כפי שנראה באיור 1B בהשוואה ל-DMSO השלילי בתרשים 1A, שם נפלטת פחות אור פלואורסצנטי אדום. הטיפול בתרכובת אחת כפי שנראה באיור 1C הוביל להיפרדות תאים או למוות תאי. לכן, איננו יכולים לטעון באופן חד-משמעי לגבי פעילות עיכוב סינתזת החלבונים שלו.

זה מחייב מחקרים נוספים של תגובת מינון כדי לנסות לקבוע אם הוא מעכב סינתזת חלבונים בריכוזים נמוכים יותר. התרכובת השנייה מציגה עיכוב בינוני של סינתזת חלבונים כפי שמוצג באיור 1D. מבחן פלואורומטרי זה הוא כלי מחקר יקר ערך ושיטה נגישה בביולוגיה כימית להכשרת סטודנטים לתואר ראשון.

על ידי מתן פרוטוקול נגיש ויעיל עם עיבוד נתונים מינימלי, הוא מעניק לסטודנטים ניסיון מעשי וטכניקות גילוי תרופות מודרניות ומאיץ את תהליך גילוי התרופות. הפרוטוקול עושה שימוש במצע פלואורסצנטי ובטכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות מתקדמות לזיהוי ומדידה שיטתית של יכולות העיכוב של תרכובות התוצר הטבעי אחת ושתיים. באמצעות ציקלוהקסמיד כמעכב ייחוס, שני המוצרים הטבעיים הראו רמות שונות של עיכוב סינתזת חלבונים.

ככל שהביקוש למעכבי סינתזת חלבונים חדשים גובר, גישה זו מציידת סטודנטים לתואר ראשון הזדמנויות מחקר משמעותיות תוך תרומה להתקדמות בתרופות בסרטן.