מיקרוסקופ ראמן רב-מודלי רחב-שדה בעל טרנספורמציה פורייה
30 בדצמבר 2025
מיקרוסקופ פורייה בעל שדה רחב, המבוסס על אינטרפרומטר דו-שבירה קומפקטי ויציב במיוחד, מאפשר רכישת ספקטרום מקבילה לכל הפיקסלים בגלאי דו-ממדי. גישת תחום הזמן מאפשרת את הפרדת הפוטולומינצנציה ואותות רמאן, ומאפשרת מיפוי ראמן מהיר (~5 מילישניות לפיקסל) ברזולוציה מרחבית ~1 מיקרומטר ורזולוציה ספקטרלית של 23 ס"מ-1 .
פיתחנו מיקרוסקופ היפרספקטרלי רב-מודלי לרכישת ספקטרום רמאן או פוטולומינצנציה מכל פיקסל בתמונה, מה שמקצר את זמן המדידה. הגישה הקונבנציונלית של קנה מידה רסטר מתבססת על ספקטרומטרים מפוזרים. טכניקות מתקדמות משפרות את אות רמאן, בין אם באמצעות אור בתהודה או באמצעות פולסים קצרים מסונכרנים שמניעים רטט מולקולרי.
חתך הפיזור התחתון של רמאן מציב שני אתגרים עיקריים. ראשית, אות חלש, שדורש זמני רכישה ארוכים. שנית, אות ראמן עשוי להיות מוצף על ידי רקע פוטולומינצנציה חזק.
ספקטרוסקופיית פורייה מאפשרת רכישת ספקטרום מקביל על פני כל הפיקסלים למדידה מהירה יותר, ודגימה מכוונת לגישה למידע ספקטרלי ספציפי כגון בידוד פסגות ראמן חלשות מרקע זוהר חזק. גישת טרנספורמציית פורייה מאפשרת דגימה חכמה וניתוח נתונים המנצלים מידע במעקבים זמניים. המטרה שלנו היא להתאים אסטרטגיות דגימה תת-ממדימה כדי לקצר עוד יותר את זמן הרכישה.
כדי להתחיל, השתמש במגרד כדי להניח 20 מיליגרם מכל אבקת פיגמנט על איזון מדויק, ולקבל יחס משקל של אחד לאחד. ערבבו את האבקות עם טיט כדי להסיר גושים. שפכו את התערובת המתקבלת על סלייד מיקרוסקופ.
לאחר מכן, השתמש בקצה המגרד כדי ללחוץ בעדינות כדי לקבל עובי כמעט אחיד של השכבה. מרחי לק על קצוות כיסוי מיקרוסקופ. מניחים אותו על התערובת כשהלק הפונה כלפי מטה, ולחץ מספיק כדי לאטום אותו.
לאחר מכן, הגדר את אורך גל העירור ומקד את לייזר העירור בכניסה של סיב הליבה הגדול רב-המצב. שים דגימת בדיקה על שלב המיקרוסקופ והפעיל את המצלמה כדי לראות את הנקודה המוארת בלייזר. חבר קטע אמצעי של הסיב לממברנה הרוטטת של סליל קול, מה שיסיר את הנקודות.
מערבל מכנית את הסיב על ידי כיפופו הדוק כדי למזג את כל מצבי המרחב שלו. הכנס מסנן פס צר ברוחב פס של 532 ננומטר עם רוחב פס של 2.0 ננומטר כדי לנקות את קו הלייזר ולדחות כל רצועות צד ספקטרליות לא רצויות של המשאבה. השתמשו במראה דיכרואית כדי להחזיר את אור הלייזר לעבר הדגימה ולשדר את הקרינה המפוזרת באדום שנאספה על ידי המטרה.
הכנס מסנן מעבר ארוך ב-532 ננומטר כדי לדחות אור אור שאריתי. מדוד את ההספק במישור הדגימה עם מד כוח. כוון את קרן המשאבה כדי לקבל עוצמה בדגימה שאינה גורמת לנזק.
עכשיו, שים את הדגימה על שלב המיקרוסקופ וכיוון את הפוקוס. הפעל את הדרייבר של המנוע שמבצע את תרגום הטריז ולחץ על אפשרות הרכישה. לאחר מכן, הגדר את פרמטרי רכישת המצלמה כמו טווח זמן וקישור חומרה כדי למקסם את עוצמת האות.
עכשיו, הגדר את אורך הצעד, מיקום הבית, ומספר הצעדים. הוסף את שם התיקייה ואת שם הקובץ. הזז את נקודת הצלב למיקום היעד ולחץ על מידה כדי להתחיל ברכישת תמונה מונוכרומטית לכל עמדת טריז.
לאחר סיום המדידה, כבו את הלייזר לפני ניתוח הנתונים. לאחר מכן, יצירת ההיפרקוביה הספקטרלית ממאגר הנתונים שנרכש על ידי טעינת קובץ התיקון של מיקום המנוע הספציפי למנוע הצעד, וקובץ כיול התדר המתאים לאינטרפרומטר. הגדר את אורך הגל לחישוב הספקטרום על ידי פורייה, תוך שינוי האינטרפרוגרמות של כל הפיקסלים.
יישם את פונקציית האפודיזציה שמציעה פשרה טובה בין הרחבת ספקטרל להפחתת ארטיפקטים, כמו חלון Happ-Genzel. לאחר מכן, נוצר את ההיפרקוביה הספקטרלית ושמור אותה בערכים מרוכבים. השיק את תוכנת הניתוח ופתח את ההיפרקוביה הספקטרלית בערכים מרוכבים.
יצירת תמונת RGB בצבע שגוי וקבלת הספקטרום הממוצע באזורים נבחרים כדי לנתח את ההיפרקוביה הספקטרלית. למדידת רמאן באותו שדה ראייה, הוסף מסנן פס במסלול הגילוי. הגדר את מסגרת הזמן ואת הקישור לחומרה, ואז הגדר את אורך המקום, מיקום הבית ומספר הצעדים.
בחר את שם הקובץ והתיקייה לשמירה לפני שלוחצים על מדידה. שלושה פיגמנטים מובחנים בבירור בשדה הראייה על פי חתימות הספקטרל של רמאן, עם שיאים אופייניים לרוטיל ב-454 ו-616 הפוך סנטימטרים, אנאטאז ב-396, 514 ו-641 סנטימטרים הפוכים, וצהוב קדמיום ב-301 ו-605 הפוך סנטימטרים. במפת הפוטולומינצנציה, צהוב קדמיום הוא הפיגמנט היחיד שמפוזר לעין בשדה הראייה, כאשר פליטה חזקה שולטת בכל התמונה.
למעשה, פליטת הפגם החלשה של רוטיל ואנאטאז אינה ניתנת להבחנה ספקטרלית מאבקה צהובה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן בפיתוח של מיקרוסקופ היפרספקטרלי מולטי-מודלי המאפשר רכישה מהירה של ספקטרום Raman ופוטולומינסצנציה מכל פיקסל בתמונה. התכנון החדשני מקצר את זמן המדידה באופן משמעותי בהשוואה לשיטות קונבנציונליות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- דימות אופטי
- ספקטרוסקופיה
רקע
- גישות קונבנציונליות לסריקה רסטרורית (raster scaling) מסתמכות על ספקטרומטרים דיספרסיביים.
- אותות רמן עשויים להיות חלשים ולדרוש זמני רכישה ממושכים.
- רקעים חזקים של פוטולומינסנציה עלולים להטביע אותות רמן.
- טכניקות מתקדמות יכולות להגביר אותות רמאן באמצעות תהודה או פולסי לייזר מסונכרנים.
מטרת המחקר
- פיתוח מיקרוסקופ המאפשר רכישה מקבילית של ספקטרוםים.
- מתן אפשרות למיפוי Raman מהיר עם רזולוציה מרחבית וספקטרלית גבוהה.
- מענה לאתגרים הנובעים מאותות Raman חלשים ומרקע של פוטולומינצנציה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פיתוח של מיקרוסקופ פורייה בתחום הרחב (wide-field Fourier-transform microscope).
- שימוש באינטרפרומטר דו-שבירה (birefringent interferometer) קומפקטי ויציב במיוחד.
- גישת מישור הזמן להפרדה בין אותות פוטולומינסנציה לאותות רמן.
- רכישה מהירה של ספקטרום בקצב של ~5 ms/pixel עם רזולוציה מרחבית של ~1-µm.
תוצאות עיקריות
- המיקרוסקופ מאפשר רכישה מקבילה של ספקטרום עבור כל הפיקסלים.
- משיג רזולוציה ספקטרלית של ~23-cm-1.
- מפחית משמעותית את זמן המדידה בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- מפריד ביעילות בין פוטולומינסצנציה לאותות רמן.
מסקנות
- המיקרוסקופ שפותח הוא כלי רב-עוצמה למיפוי Raman מהיר.
- הוא נותן מענה לאתגרים מרכזיים ברכישת ספקטרומי Raman בדגימות ביולוגיות.
- לטכנולוגיה זו יישומים פוטנציאליים בתחומי מחקר שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיית רמן בטרנספורמציית פורייה בשדה רחב (Wide-field Fourier-transform Raman microscopy) מאפשרת מיפוי כימי מהיר וברוזולוציה גבוהה של דגימות מורכבות, ובכך נותנת מענה לאתגרי תפוקה והפרעות רקע בשלבי הגילוי המוקדמים. יכולת זו תומכת בתיקוף יעדים (target validation) חסון ובצמצום סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת מידע מולקולרי כמותי בעל רזולוציה מרחבית. רכישת ספקטרום מואצת משפרת את קבלת ההחלטות בנקודות מפנה מרכזיות בקווי המחקר והפיתוח של תעשיית הביופרמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מיפוי הרכב כימי בתפוקה גבוהה לצורך תיקוף של מטרות תפקודיות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי הבחנה בין אותות רמאן (Raman) חלשים לרקע של פוטולומינסנציה.
- תומך בביטחון חיזוי בחקירת מסלולים באמצעות נתונים ספקטרליים כמותיים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין מערכי נתונים היפר-ספקטרליים שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה של סריקה בהמשך התהליך.
- מספק פלטים כמותיים הניתנים לשחזור על פני שטחי דגימה גדולים עם זמן שהייה מינימלי.
- מאפשר סטנדרטיזציה ונתיב הרחבה (scalability) של הבדיקה באמצעות ביצוע מקבילי של רכישת ספקטרום.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מספק חתימות מולקולריות ברזולוציה מרחבית הרלוונטיות למודלים של מחלות, במידה ורלוונטי.
- שומר על רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תמיכה באפיון כימי חסון.
- מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים על ידי הבהרת ההטרוגניות וההרכב של הדגימה.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
מיקרוסקופ Raman רב-מודאלי זה משתלב ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהוא מאפשר מיפוי כימי כמותי ומהיר בשלבים מוקדמים ובינוניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות דימות היפר-ספקטרלי.
- סריקה: מספק נתונים ספקטרליים הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק ספקטרה כמותית ברזולוציית פיקסלים להשוואה סטטיסטית חזקה.
- מחקר תרגומי: מתאימה את תוצרי הדימות המולקולרי לדרישות של מודלים פרה-קליניים כאשר הדבר רלוונטי.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת להרחבה ולהתאמה לשימוש חוזר בסוגי דגימות מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מאיץ את רכישת הנתונים וממסד את תהליכי העבודה של ניתוח ספקטרלי.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לניתוח מהיר ועשיר בתוכן.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום תוכניות גילוי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימות היפר-ספקטרלי ובספקטרוסקופיית רמאן (Raman spectroscopy).
- דורש גישה למיכשור אופטי מתקדם ולתשתית ניתוח נתונים.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי הרכישה והניתוח.
- עשוי לדרוש התאמה עבור סוגי דגימות שונים או מטריצות ביולוגיות שונות.
- הביצועים עשויים להיות מוגבלים עקב פוטולומינסנציה של הדגימה או פיזור רמאן חלש בהקשרים מסוימים.
