ניתוח התנהגותי של תפקוד לקומוטורי ב-Drosophila melanogaster כקריאה לרעילות עצבית

מטרת המחקר שלנו היא לפתח שיטה חסכונית וחיובית אתית לסינון תרכובות נוירוטוקסיות. שיטות מסורתיות של בדיקות טוקסיקולוגיה מסתמכות לרוב על מודלים וירטואליים של תעריף וירטואלי, שהם יקרים, גוזלים זמן, אחרת חששות אתיים כידוע. רצינו לחקור אם אנו יכולים לזהות סימנים מוקדמים של רעילות עצבית באמצעות מודל חלופי כמו Drosophila melanogaster שהוא גם רגיש וגם ניתן להרחבה. פרוטוקול זה מסייע לנו לזהות פנוטיפים התנהגותיים כגון שינויים בדפוסי תנועה ופעילות היריפריות, אך גם ירידה מוטורית מתקדמת או שיבושים כתובים באבטחה, וגם ההעדפה הרחבה נבדקת.

מה שהופך את יתרונות הפרוטוקול שלנו הוא שהוא משלב את מבחן הטיפוס הקלאסי עם טכנולוגיית ניטור בזמן אמת, וזה מאפשר לנו ללכוד ליקויים מוטוריים עדינים שעלולים להחמיץ. בשיטות מסורתיות המספקות רגישות גבוהה יותר ונתוני התנהגות מדויקים יותר.

[קריין] כדי להתחיל, העבירו בעדינות את הזבובים לבקבוק ריק. הניחו את הבקבוק המכיל את הזבובים בתוך קופסה מלאה בקרח, וודאו שהבקבוק כולו מכוסה. לאחר דקה אחת, הקש בעדינות על הבקבוק כדי לוודא שכל הזבובים מורדמים. הכן מיכל קטן יותר מלא בקרח. הניחו צלחת פטרי או משטח נקי ושטוח על גבי הקרח ליצירת פלטפורמה צוננת. כעת הפוך את הצינור מעל צלחת הפטרי המצוננת והקש בעדינות כדי לשחרר את הזבובים על המשטח הקר. העבירו בזהירות את הזבובים לבקבוקונים ריקים. אפשרו לזבובים להתאושש מההרדמה למשך 30 דקות בסביבה מבוקרת בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם מחזור אור חושך של 12 שעות ו-50% לחות. לאחר מכן, להכנת הזנה מיקרו-נימית, השתמש בפיפטה כדי לטעון ידנית 10 מיקרוליטר מתמיסת הבדיקה לכל צינור מיקרו-נימי, מה שמבטיח נפח עקבי בכל הדגימות. הוסף שלושה עד חמישה מיקרוליטרים של שמן מינרלי לקצה הפתוח של כל צינור מיקרו-נימי כדי למנוע אידוי ודליפה במהלך הניסוי. הכנס את המיקרו-נימים הממולאים מראש דרך חורים בתקעי בקבוקון הכותנה, והבטיח התאמה בטוחה. הניחו את הבקבוקונים המכילים זבובים באינקובטור המכוון ל-25 מעלות צלזיוס עם מחזור חושך בהיר של 12 שעות, והשאירו את הבקבוקונים בחממה למשך הניסוי. כל 12 שעות, העבירו את הזבובים לבקבוקון נקי וריק כדי להעריך את פעילותם התנועתית. מדוד וסמן קו שבעה סנטימטרים מתחתית הבקבוקון באמצעות טוש קבוע. סימן זה ישמש כיעד הטיפוס. מקם מצלמה או טלפון במיקום יציב כדי לתעד את התנהגות הטיפוס. הקפידו על תאורה נכונה ורקע שקוף כדי לאפשר נראות וניתוח ברורים. ודא שההגדרה הניסיונית תואמת לשדה הראייה של המצלמה והתחל להקליט. סקור את הקלטות הווידיאו ומדוד את הזמן שלוקח לכל זבוב להגיע לסימן שבעת הסנטימטרים. הכן את המיקרו-נימי ההזנה עם הדגימה ואטם השמן המינרלי כפי שהוצג קודם לכן. לאחר מכן הכינו תאי תנועה בודדים באמצעות קשיות פלסטיק שקופות שנחתכו לאורך של כשישה סנטימטרים. אטמו קצה אחד של כל קשית בסרט שקוף ליצירת סגירה אטומה. ליד הקצה האטום של הקשית, צור חור קטן כדי להכניס את המיקרו-נימי ההזנה, וודא שהוא מתאים היטב ואינו דולף או זז במהלך הבדיקה. לאחר הרדמה והפרדה של הזבובים כפי שהוצג קודם לכן, הניחו בעדינות זבוב מורדם אחד לכל צינור באמצעות מברשת צבע עדינה. אטום את הקצה הפתוח של כל צינור עם סרט שקוף או פקק כותנה, המאפשר זרימת אוויר תוך מניעת בריחה. כעת הכנס מיקרו-נימי מילוי מראש לכל תא מוכן דרך החור המיועד. הנח את הצינורות המורכבים בזירת הבדיקה, וודא שהמיקרו-נימים נשארים נגישים להחלפה יומיומית. הנח את כל ההתקנה בתוך תא הנשמר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם מחזור חושך בהיר של 12 שעות ו-50% לחות. חבר את המכשיר למערכת המעקב המקומית או לרשת. גש לפלטפורמת התוכנה ואתר את המכשיר שהוקצה לניסוי. ודא שהמערכת עוקבת נכון אחר כל זבוב על סמך סמנים חזותיים. הזן את כל המטא נתונים הניסיוניים והתחל להקליט את הבדיקה. יכולת הטיפוס שהוערכה באמצעות מבחן גיאוטקסיס שלילי ב-24 ו-48 שעות מראה ביצועים דומים בין קבוצת הביקורת לקבוצת הטיפול ב-24 שעות, מה שמצביע על כך שאין ליקויים מוטוריים מיידיים. ב-48 שעות לוקח לזבובים המטופלים כמעט פי שניים יותר זמן לטפס בהשוואה לבקרות המשקפות ליקוי מוטורי משמעותי. מעקב פעילות רציף מגלה כי זבובים שטופלו מציגים בתחילה תנועה מוגברת, אך פעילותם יורדת בחדות לאחר 12 שעות, מה שמצביע על ריגוש יתר מוקדם ואחריו תפקוד מוטורי מופחת. לאחר 24 עד 40 שעות, הזבובים שטופלו הראו תנועה מופחתת בהשוואה לקבוצת הביקורת. בסך הכל לזבובים שטופלו יש פעילות מופחתת בכ-20% לאורך 40 שעות. זבובים שטופלו הגיבו בתחילה בעיכוב לרמזי האור ואחריו יישור צירקדי חולף, אך איבדו בהדרגה את הקצב ב-48 שעות, ככל הנראה כתוצאה מגירעון בקטר. זבובים מטופלים מעדיפים אזורי אור יותר מאשר בקרות.