Name: במבחנה בנייה מחדש של רשתות שלד ציטו בתוך שלפוחיות ענק חד-שלדיות מופרדות (GUVs) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: למד שיטה לבנייה מחדש של רשתות שלד ציטו בתוך שלפוחיות ענק חד-שלדיות מופרדות (GUVs). השיטה מאפשרת כליאה רב-תכליתית של ביומולקולות תוך שמירה על תפקוד חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+and+polymersomes%3A+a+comparative+review+towards+cell+mimicking%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li>
<li>Imai, M., Walde, P. Giant unilamellar vesicles: From protocell models to the construction of minimal cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aImai%2C+M+%22The+Giant+Vesicle+Book%22">The Giant Vesicle Book</a>. , (2019).</li>
<li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome%3A+classification%2C+preparation%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Res+Lett%22%5BJournal%5D)">Liposome: classification, preparation, and applications.</a> Nanoscale Res Lett. 8 (1), 102(2013).</li>
<li>Litschel, T., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Reconstitution+Inside+Giant+Unilamellar+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Protein Reconstitution Inside Giant Unilamellar Vesicles.</a> Annu Rev Biophys. 50 (1), 100620-114132 (2021).</li>
<li>Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+giant+vesicles.+Probing+the+membrane+nanoregime+via+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Condens+Matter%22%5BJournal%5D)">A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy.</a> J Phys Condens Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Liposome electroformation.</a> Faraday Discuss Chem Soc. 81 (0), 303-311 (1986).</li>
<li>Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+droplet+interface+crossing+encapsulation+%28cDICE%29+for+high+throughput+monodisperse+vesicle+design%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design.</a> Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).</li>
<li>Dürre, K., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+phase+separated+vesicles+by+double+layer+cDICE%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Formation of phase separated vesicles by double layer cDICE.</a> Soft Matter. 15 (47), 9676-9681 (2019).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octanol-assisted+liposome+assembly+on+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Octanol-assisted liposome assembly on chip.</a> Nat Commun. 7 (1), 10447(2016).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+Vesicles%3A+Preparations+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Giant Vesicles: Preparations and applications.</a> ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).</li>
<li>Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+Inverted+Emulsion+Method+for+High-Yield+Production+of+Biomimetic+Giant+Unilamellar+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Optimization of the Inverted Emulsion Method for High-Yield Production of Biomimetic Giant Unilamellar Vesicles.</a> ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).</li>
<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+serves+as+a+membrane+domain+switch+in+model+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers.</a> Biophys J. 91 (11), 4064-4070 (2006).</li>
<li>Lopes dos Santos, R., Malo, M., Campillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Control+of+Arp2%2F3-Induced+Actin+Polymerization+on+Phase-Separated+Giant+Unilamellar+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial Control of Arp2/3-Induced Actin Polymerization on Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles.</a> ACS Synth Biol. 12 (11), 3267-3274 (2023).</li>
<li>Sun, Q., Fu, Y., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effects+on+hydrophobic+interactions%3A+Implications+for+protein+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Temperature effects on hydrophobic interactions: Implications for protein unfolding.</a> Chem. Phys. 559, 111550(2022).</li>
<li>Zimmerle, C. T., Frieden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+temperature+on+the+mechanism+of+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of temperature on the mechanism of actin polymerization.</a> Biochemistry. 25 (21), 6432-6438 (1986).</li>
<li>Concha-Marambio, L., Maldonado, P., Lagos, R., Monasterio, O., Montecinos-Franjola, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+adaptation+of+mesophilic+and+thermophilic+FtsZ+assembly+by+modulation+of+the+critical+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Thermal adaptation of mesophilic and thermophilic FtsZ assembly by modulation of the critical concentration.</a> PLoS One. 12 (10), e0185707(2017).</li>
<li>Kanwa, N., Kohyama, S., Fröhlich, L., Desai, A., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+dependence+between+membrane+phase+separation+and+bacterial+division+protein+dynamics+in+synthetic+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Mutual dependence between membrane phase separation and bacterial division protein dynamics in synthetic cell models.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 64 (6), e202417800(2025).</li>
<li>Reverte-López, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organized+spatial+targeting+of+contractile+actomyosin+rings+for+synthetic+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Self-organized spatial targeting of contractile actomyosin rings for synthetic cell division.</a> Nat Commun. 15 (1), 10415(2024).</li>
<li>dos Santos, R. L., Campillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+actin-induced+cell+shape+changes+using+Giant+Unilamellar+Vesicles+and+reconstituted+actin+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Studying actin-induced cell shape changes using Giant Unilamellar Vesicles and reconstituted actin networks.</a> Biochem Soc Trans. 50 (5), 1527(2022).</li>
<li>Staufer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+production+and+characterization+of+biofunctionalized+giant+unilamellar+vesicles+for+targeted+intracellular+cargo+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Microfluidic production and characterization of biofunctionalized giant unilamellar vesicles for targeted intracellular cargo delivery.</a> Biomaterials. 264, 120203(2021).</li>
<li>Lopes, D., Jakobtorweihen, S., Nunes, C., Sarmento, B., Reis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+puzzle+of+drug-membrane+interactions%3A+Experimental+techniques+and+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the puzzle of drug-membrane interactions: Experimental techniques and molecular dynamics simulations.</a> Prog Lipid Res. 65, 24-44 (2017).</li>
<li>Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+interactions+with+model+lipid+membranes%3A+applications+in+drug+discovery+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Biophysical interactions with model lipid membranes: applications in drug discovery and drug delivery.</a> Mol Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).</li>
<li>Schulz, M., Werner, S., Bacia, K., Binder, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Molecular+Recognition+with+Lipid%2FPolymer+Domains+in+Vesicle+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Controlling Molecular Recognition with Lipid/Polymer Domains in Vesicle Membranes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 52 (6), 1829-1833 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (מלח נתרן) (DOPG)</td><td>שומנים קוטביים של Avanti</td><td>840475</td><td>בכלורופורם</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td><td>שומנים קוטביים של Avanti</td><td>850375</td><td>בכלורופורם</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (מלח נתרן) (18:1 מכסה ביוטיניל PE)</td><td>ליפידים קוטביים של Avanti</td><td>870273</td><td>ב כלורופורם</td></tr><tr><td>1,2-דיפלמיטויל-sn-גליצרו-3-פוספו-(1'-rac-גליצרול) (מלח נתרן) (DPPG)</td><td>שומנים קוטביים</td><td>של</td><td>אוונטי 840455 בכלורופורם</td></tr><tr><td>1,2-דיפלמיטויל-sn-גליצרו-3-פוספוכולין (DPPC)</td><td>שומנים קוטביים של אוונטי</td><td>850355</td><td>בכלורופורם</td></tr><tr><td>עם 96 בארות מיקרו-פלטה שטוחה (SensoPlate)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אקטין (אלפא-אקטין שריר שלד, ארנב)</td><td>HYPERMOL</td><td>8101-01</td><td></td></tr><tr><td>Atto488-Actin (אלפא-אקטין שריר השלד, ארנב)</td><td>HYPERMOL</td><td>8153-01</td><td></td></tr><tr><td>Atto655-DOPE</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 655-16</td><td>אבקת</td></tr><tr><td>סוניקטור</td><td>לאמבט ברנסון&nbsp;</td><td>1510R-MTH</td><td>Bransonic מנקה אולטראסוני</td></tr><tr><td>ביוטין-אקטין (שריר השלד אלפא-אקטין, ארנב)</td> <td>HYPERMOL</td><td>8109-01</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול (ovine)</td><td>Avanti Polar lipids</td><td>700000</td><td>בכלורופורם</td></tr><tr><td>Decane</td><td>TCI Deutschland GmbH</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>Fascin (אנושי, רקומביננטי)</td><td>Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)</td><td>CS-FSC01-A</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll70</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2878</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol (OptiPrep)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>LSM800 לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורק</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>C-Apochromat 40&thinsp; וזמנים; &thinsp;/1.2 מטרת טבילה במים. לייזרים במצב מוצק עם דיודה: 488&thinsp; ננומטר ו-640&thinsp; ננומטר.</td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>מיוזין II (שריר השלד של ארנב)</td><td>Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)</td><td>MY02-A</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>אוסמומטר</td><td>Fiske Associates</td><td></td><td>פיסקה מיקרו-אוסמומטר דגם 120</td></tr><tr><td>גריינר ביו-וואן</td><td>&nbsp; גמב"ה</td><td>07-000-109</td><td></td></tr></tbody></table>

במבחנה בנייה מחדש של רשתות שלד ציטו בתוך שלפוחיות ענק חד-שלדיות מופרדות (guvs)

In vitro Reconstitution of Cytoskeletal Networks inside Phase Separated Giant Unilamellar Vesicles (GUVs)

כצעד ראשון, GUVs עם הפרדת פאזה ממברנה יוצרו בעקבות גישת אמולסיה הפוכה שונה (איור 1A). התוצאה היא תפוקה גבוהה של GUVs, המציגים ממברנה מעורבבת לתחומי Ld ו-L, כפי שמיוצג על ידי תווית Atto 655-DOPE על תחום Ld ואזורים כהים המתאימים לתחומי Lo לא מסומנים (איור 1B). שיטה זו מניבה GUVs מופרדים-פאזה בגדלים הנעים בין 5-30 מיקרומטר (איור 1C) בטמפרטורות גבוהות (כל השלבים מבוצעים ב-37 מעלות צלזיוס ומצולמים ב-RT). יתר על כן, מהירויות הצנטריפוגה הותאמו כדי להבטיח את שילוב השומנים המרכיבים המקוריים בתוך GUVs וכן כדי למנוע אוכלוסיית יתר מוגזמת.
יתר על כן, כדי להדגים את האנקפסולציה המוצלחת של ביומולקולות בשיטת האמולסיה המתוארת בפרוטוקול הנוכחי, הן רשתות FtsZ והן רשתות אקטין נבנו מחדש בניסויים בודדים. רשתות FtsZ מסוכמות בתוך GUVs, אשר מופיעים כחוטים הנקשרים באופן מועדף לתחומי Ld באמצעות רצף מיקוד הממברנה שלהם (MTS) בנוכחות 2.5 mM GTP ו-50 g/L Ficoll70 (כפי שמתואר באיור 2). הרשתות נצפו כשעה לאחר שלב האנקפסולציה. עם זאת, רשתות אקטומיוזין מופיעות כצרורות דקים (בניגוד לרשתות עבות של FtsZ) לאחר בנייה מחדש בתוך GUVs (איור 3). יש לציין כי ליפידים ביוטיניליים ממלאים תפקיד מכריע בקשירת רשתות האקטומיוזין לקרום ה-GUVs. ללא ליפידים ביוטיניליים, צרורות אקטומיוזין אינם יכולים לאמץ תצורה מעוקלת ולהישאר כצרורות ישרים, קצרים ונוקשים בלומן במקום להיצמד לממברנה כרשת סבוכה של צרורות ארוכים (איור 4).
בפרוטוקול האמולסיה המותאם, מהירות הצנטריפוגה מותאמת להשגת GUVs מופרדים פאזה, כפי שהוזכר קודם לכן. ואכן, מהירויות צנטריפוגה גבוהות יותר עם דגימות המכילות רשתות אקטומיוזין (600 x g למשך 15 דקות) גורמות לצבירת שלפוחיות לתצורה דמוית רקמה בתוך באר הייצור. לפיכך, בכל ניסויי הבנייה מחדש הסטנדרטיים של רשתות אקטומיוזין, מהירות הצנטריפוגה האופטימלית הוגדרה ל-200 x g כדי להשיג GUVs לא מצטברים (איור 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig1.jpg"> 
איור 1: יצירת סיר אחד של GUVs מופרדים פאזה תוך שימוש בשיטת העברת תחליב כפול. (A) סכמה ניסויית של שלבי המפתח בייצור סיר אחד של שלפוחיות מופרדות פאזה באמצעות העברת תחליב כפולה. (B) תמונת הקרנת Z קונפוקלית של ה-GUVs המתקבלים שנוצרו בעקבות השיטה המתוארת ב-A. סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר. (C) גרף עמודות עם חלק ה-GUVs המופרדים פאזה שנוצר בהתאם לקוטר שלהם. ניסויים שבוצעו n = 3, המספר הכולל של GUVs שנותחו לכל ניסוי = 100. נתונים המוצגים כערכים ממוצעים, נקודות נתונים בודדות הן שלושת הניסויים הבלתי תלויים. קווי שגיאה מייצגים את סטיית התקן של שלושת הניסויים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig2.jpg"> 
איור 2: שלפוחיות מופרדות פאזה עם רשתות FtsZ עטופות. (A) תמונות הקרנה תלת-ממדיות קונפוקליות המבוצעות על מחסנית z נרכשת במלואה של GUV מופרד פאזה המכיל רשת FtsZ. (B) תמונות הקרנת Z קונפוקליות שמבוצעות רק בחצי העליון של השלפוחית. בשל היווצרות הטרוגנית של תחומים על פני השטח של ה-GUV, השחזור התלת-ממדי של הפרוסות הקונפוקליות הנרכשות מראה חפיפה של תחומי שומנים מהאזורים העליונים והתחתונים של השלפוחית. כדי למנוע חפיפה ולהקל על הבדיקה החזותית של הדומיינים, המחצית התחתונה של ערימות ה-z שנרכשו מוסרות מהקובץ. החצי העליון שנוצר משמש לאחר מכן להקרנה תלת-ממדית באמצעות סטיית תקן. פסי קנה המידה הם שניהם 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig3.jpg"> 
איור 3: שלפוחיות מופרדות פאזה עם רשתות אקטומיוזין עטופות. (A) תמונות הקרנה Z קונפוקליות של ערימה נרכשת שלמה עם זום-אאוט של הבאר לאחר ייצור השלפוחית. התשואה הגבוהה של השלפוחיות המתקבלות מאפשרת לחקור מבני אקטומיוזין שונים בתוך השלפוחית. סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר. (B) תמונות הקרנת Z קונפוקליות המבוצעות בחצי העליון של שלפוחית. כדי להקל על הניתוח החזותי של תחומי השומנים, רק המחצית העליונה של פרוסות התמונה משמשת לביצוע הקרנה תלת מימדית. סרגל קנה המידה הוא 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig4.jpg"> 
איור 4: חשיבותם של ליפידים ביוטיניליים ליצירת רשתות אקטומיוזין הקשורות לממברנה בתוך שלפוחיות מופרדות פאזה. הקרנות תלת מימד קונפוקליות המתארות שלפוחיות מופרדות פאזה עם רשתות אקטומיוסין שאינן מחוברות. אם ליפידים ביוטיניליים אינם משולבים בתערובת, נוצרים מבני אקטומיוזין בלומן ואינם רוכשים תצורה מעוקלת על העלון הפנימי של השלפוחיות (פאנל ימני, אקטין מסומן ב-Atto488). סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig5.jpg"> 
איור 5: השפעת מהירות הצנטריפוגה על ייצור שלפוחיות מופרדות פאזה באמצעות העברת אמולסיה. תמונות דו-ממדיות קונפוקליות המציגות דגימת GUV שנוצרה על ידי הפעלת כוח צנטריפוגה של 600 x g למשך 15 דקות. מהירות הצנטריפוגה המופעלת, גבוהה מ-200 x g האופטימלית, מביאה לצבירת שלפוחיות לתצורה דמוית רקמה בתוך הבאר. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

במבחנה בנייה מחדש של רשתות שלד ציטו בתוך שלפוחיות ענק חד-שלדיות מופרדות (GUVs)

Biomimetic lipid membranes in the form of giant unilamellar vesicles (GUVs) are commonly used to mimic cellular membrane behavior because of the ease of ...

in-vitro-reconstitution-cytoskeletal-networks-inside-phase-separated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

הכינון מחדש של החלבון הטרנסממברני, KvAP, לתוך שלפוחית ​​unilamellar ענקית (GUVs) הוא הוכיח לשתי שיטות התייבשות-החזרת נוזלים - electroformation, ונפיחות בסיוע ג '. בשני השיטות, שלפוחית ​​unilamellar קטנה המכילה החלבון הם התמזגו יחד כדי ליצור GUVs כי אז יכול להיות שנחקר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק.

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

שלפוחיות ענקיות המכילות רכיבים בגודל מיקרומטר ארוזים מאוד הן מודלים שימושיים של תאים. שיטת הצנטריפוגה של תחליב מים בשמן היא כלי פשוט ורב עוצמה להכנת שלפוחיות ענק עם חומרים עטופים.

הכנת ענק שלפוחית ​​encapsulating מיקרוסכמות על ידי צנטריפוגה של אמולסיה מים ב-שמן

ניסויים שלב מופרדים unilamellar ענק שלפוחית (כשמרוגזים) לעתים קרובות להזניח את התנאים פיזיולוגית. עבודה זו מציג גישות לחקר השפעת מליחות גבוהה מאגר על נוזל-נוזל שלב ההפרדה בין האנשים שנגדם ל טעונה כפונקציה של טרנס-הממברנה לפתרון האסימטריה ואת הטמפרטורה.

שלב התנהגות של שלפוחית טעונה בתנאים פתרון סימטרי אסימטרי במעקב עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

חלבונים רבים בתא לחוש, זירוז עקמומיות ממברנה. אנו מתארים שיטה למשוך ממברנה צינוריות מן השומנים שלפוחית את האינטראקציה של חלבונים או כל מולקולה עקמומיות-פעיל עם ממברנות מעוקל חוץ גופית בתוך.

משיכת ממברנה צינוריות מן שלפוחית Unilamellar ענק

אנו מציגים טכניקה עבור המיקרומניפולציה ללא מגע של שלפוחית, באמצעות מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות. Microinjection של פתרון יון סידן, באזור שלפוחית השומנים ענק, מנוצל כדי לשפץ ממברנה השומנים, וכתוצאה מכך הייצור של בליטות צינורי ממברנה.

ממברנה שיפוץ של שלפוחית ענקית בתגובה מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות

מאמר זה מציג שיטה פשוטה לייצור מהיר של שלפוחיות חד-שכבתיות ענקיות עם חלבוני שלד ציטוסקטליים עטופים. השיטה מוכיחה את עצמה כיעילה לשילוב מחדש מלמטה למעלה של מבנים ציטוסקטליים באינטראקציות כליאה וציטוסקלטון-ממברנה.

אנקפסולציה מהירה של שלד ציטוסקי משוחזר בתוך בועיות יונילאמלריות ענקיות

ספטינים הם חלבונים ציטוסקטליים. הם מתקשרים עם ממברנות שומנים ויכולים לחוש אך גם ליצור עקמומיות ממברנה בקנה מידה של מיקרון. אנו מתארים בפרוטוקול זה מתודולוגיות in vitro מלמטה למעלה לניתוח עיוותים של ממברנות, קשירת ספטין רגישה לעקמומיות ואולטרה-מבנה של נימה ספטין.

מלמטה למעלה בשיטות במבחנה כדי לבחון את הארגון האולטרה-סטרוקטורלי, עיצוב מחדש של הממברנה והתנהגות הרגישות לעקמומיות של מחיצות

בכתב יד זה, אנו מדגימים את הטכניקות הניסיוניות לתמצת את השלד הציטוסקולרי F-actin לשלפוחיות ליפידים חד-עיניות ענקיות (הנקראות גם ליפוזומים), ואת השיטה ליצירת שכבת F-actin הביולוגית של קליפת המוח בעלון הפנימי של קרום הליפוזום.

במבחנה שחזור של שלד אקטין ציטוסקלטון בתוך שלפוחית אונילמלרית ענקית

אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה ועטיפת אנזימים ורכיבים מסיסים אחרים במים בשלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטר ומיקרומטר.

בניית רשתות מטבוליות מחוץ לשיווי משקל בשלפוחיות בגודל ננו ומיקרומטר

מאמר זה מציג שיטה להכנת שלפוחיות ענק חד-תכליתיות (cGUVs) בעלות מבנה שלפוחית בתוך שלפוחית, עם מוליכות חשמלית מותאמת אישית באזורים פנימיים, טבעתיים וחיצוניים. אלקטרופורמציה מסנתזת GUVs פשוטים, שהופכים לסטומטוציטים ו-cGUVs באמצעות הלם אוסמוטי, ומספקים מודל רב ערך לחקר הביופיזיקה של תאים גרעיניים.

סינתזה של שלפוחיות חד-כיווניות ענקיות: מודל ביומימטי של תאים גרעיניים

למד שיטה לבנייה מחדש של רשתות שלד ציטו בתוך שלפוחיות ענק חד-שלדיות מופרדות (GUVs). השיטה מאפשרת כליאה רב-תכליתית של ביומולקולות תוך שמירה על תפקוד חלבונים.

במבחנה בנייה מחדש של רשתות שלד ציטו בתוך שלפוחיות ענק חד-שלדיות מופרדות (GUVs)

גלה סרטונים נוספים