במבחנה בנייה מחדש של רשתות שלד ציטו בתוך שלפוחיות ענק חד-שלדיות מופרדות (GUVs)

מאמר זה מציג בנייה מחדש פשוטה של סיר אחד של רשתות שלד ציטו בתוך שלפוחיות ענק מופרדות פאזה. ניתן להכליל את השיטה וליישם אותה על אנקפסולציה או כליאה של מגוון רחב של ביומולקולות.

המחקר שלנו בוחן אם תא סינתטי מינימלי יכול לשכפל פונקציות ביולוגיות מרכזיות, תוך התמקדות בתכנון ממברנות המחקות מקרוב את המבנה וההתנהגות של ממברנות תאיות טבעיות.

טכנולוגיות שונות משמשות לייצור שלפוחיות מופרדות פאזה ושימוש במיקרו-נשאים אלה למגוון יישומים. הטכנולוגיות, למשל, הן cDICE שכבה כפולה ואלקטרופורמציה. אתגר מרכזי אחד הוא שמירה על פונקציונליות החלבון תוך יצירת הפרדת פאזה על שלפוחית הממברנה. העלאת הטמפרטורה עלולה לערער את יציבות החלבונים וביו-מולקולות אחרות.

[קריין] כדי להתחיל, השג בקבוקונים של תערובות ליפידים ביוטיניליות ולא ביוטיניליות. ממיסים 50 מיקרוליטר מכל תערובת ליפידים של 32 מילי-מולרית בכלורופורם. לאחר מכן, יבש אותם בשני בקבוקוני זכוכית תחת זרימת גז חנקן למשך כ-15 דקות. הניחו את בקבוקוני הזכוכית בחומר ייבוש. אחסן אותם בוואקום למשך כ-30 דקות כדי להסיר שאריות כלורופורם. כעת, פזרו את סרטי השומנים המיובשים בתערובת של 20 מיקרוליטר דקאן ו-500 מיקרוליטר שמן מינרלי באותם בקבוקונים כדי להשיג ריכוז שומנים סופי של 3.2 מילי-מולאר. בעזרת סוניקטור אמבטיה, סוניקטור את שתי התערובות בכ-50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו את תערובות השומנים והשמן לשני צינורות. בזמן הדגירה, הכינו את תערובת האנקפסולציה הפנימית לחלבונים. להכנת תערובת החלבון FtsZ, הוסף את הריאגנטים המפורטים לנפח סופי של 10 מיקרוליטר בצינור. שמור את התערובת על קרח עד לשימוש. למעטפת צרורות אקטין, הכינו תחילה 10 מיקרוליטר מתערובת מאסטר אקטין, המכילה 86% G-אקטין, 10% ATTO 488 אקטין ו-4% אקטין ביוטיניל במים. שמור את התערובת על קרח והגן עליה מפני אור. רגע לפני השימוש, הכינו את תמיסת האקטין הסופית על ידי הוספה, לפי הסדר, יודיקסאנול, מים, NeutrAvidin, BSA, Ficoll 70, מאגר פילמור אקטין 10x, A-Mix, fascin ו-ATP. מערבבים היטב, ומשתמשים בחמישה מיקרוליטרים למעטפת. כדי לעטוף את FtsZ, פיפטה 500 מיקרוליטר של מאגר תגובה FtsZ לתוך צינור פלסטיק של 1.5 מיליליטר. הוסיפו בעדינות 200 מיקרוליטר של תערובת שומנים ושמן ליצירת ממשק שמן-מים. בשפופרת שנייה מוסיפים 200 מיקרוליטר תערובת שומנים ושמן. דגרו את הצינור הזה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, פיפטה חמישה מיקרוליטרים מתערובת החלבון FtsZ לצינור השומן והשמן המודגר ומאפשר לו לשקוע כטיפה. הקש בעדינות על הצינור חמש עד שש פעמים, עד שהתמיסה הופכת עכורה, ליצירת תחליב. פיפטה בזהירות תחליב זה על גבי ממשק שמן-מים שהוכן קודם לכן. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-6,000 גרם למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. מצננים את הדגימה לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. כעת, השתמש בפיפטה כדי להסיר בעדינות את שכבת השמן העליונה, והשאיר 100 עד 200 מיקרוליטר של תמיסה להדמיה. חותכים קצה פיפטה בזווית. השתמש בו כדי לאחזר 50 עד 100 מיקרוליטר של תמיסת GUV מתחתית הצינור. כדי לעטוף אקטין ישירות בצלחת של 96 בארות, שלב 198 מיקרוליטר של שני גלוקוז מולארי עם 802 מיקרוליטר מים כדי להכין תמיסת גלוקוז חיצונית התואמת את האוסמולריות של תערובת האקטין הפנימית. פסיביים באר של צלחת 96 בארות על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 10 גרם לליטר BSA לבאר. לאחר דגירה של 10 עד 15 דקות, יש לשטוף את הבאר חמש פעמים עם 100 מיקרוליטר תמיסה חיצונית. השאירו 100 מיקרוליטר מהכביסה הסופית. כעת, הוסיפו בעדינות 50 מיקרוליטר של תערובת שומנים ושמן לבאר על ידי הנחת הפיפטה על הדופן כדי להבטיח שכבות נכונות על גבי התמיסה החיצונית. בצינור נפרד מוסיפים 100 מיקרוליטר שומנים בשמן, ודוגרים. הוסף 2.5 מיקרוליטר של תמיסת אקטין סופית לצינור השומנים והשמן המודגרים, ואפשר לו לשקוע כטיפה. הקש בעדינות על תחתית הצינור 10 עד 20 פעמים, עד שהתערובת הופכת עכורה. פיפטה בעדינות את האמולסיה במרכז שכבת השמן בבאר, מבלי לשבור את הממשק. לאחר מכן, צנטריפוגה את צלחת 96 הבארות ב -200 גרם למשך 20 דקות ב -37 מעלות צלזיוס. הניחו לצלחת להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני ההדמיה. התקבלה שלפוחיות חד-כיווניות ענקיות, או GUVs, עם ממברנות מעורבבות לתחומים עם הפרעות נוזליות ומסודרות נוזלית, ותפוקה גבוהה של שלפוחיות בגודל של בין חמישה ל-30 מיקרומטר. רשתות FtsZ סוכמו בתוך ה-GUVs ומוקמו באופן מועדף לתחומי הממברנה הנוזלית בנוכחות GTP ו-Ficoll 70. רשתות אקטין, כאשר נוצרו מחדש, הופיעו כצרורות דקים הנצמדים לממברנה, ויוצרות מבנים דלילים דמויי קורים. ללא ליפידים ביוטיניליים, צרורות האקטין לא הצליחו להיצמד לממברנה, ובמקום זאת נשארו נוקשים וישרים בתוך לומן השלפוחית. בתנאי צנטריפוגה גבוהים יותר, שלפוחיות המכילות מיוזין אקטין הצטברו לארכיטקטורה דמוית רקמה ארוזה בבאר הייצור.