Name: זיהוי מטבולי בזמן אמת בתאים חיים באמצעות תמג היפרפולרי 13C (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-08T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: למד מעקב מטבולי בזמן אמת בתאים חיים באמצעות תמ"ג היפרפולרי ¹³C. פרוטוקול זה משלב ביוריאקטור מותאם עם ספקטרוסקופיית NMR לבחינת מטבוליזם פירובט ויישומי סקרינג תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+signal-to-noise+ratio+of+%26gt%3B10%2C000+times+in+liquid-state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Increase in signal-to-noise ratio of &gt;10,000 times in liquid-state NMR.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (18), 10158-10163 (2003).</li>
<li>Comment, A., Merritt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+magnetic+resonance+as+a+sensitive+detector+of+metabolic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized magnetic resonance as a sensitive detector of metabolic function.</a> Biochemistry. 53 (47), 7333-7357 (2014).</li>
<li>Balzan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissolution+Dynamic+Nuclear+Polarization+Instrumentation+for+Real-time+Enzymatic+Reaction+Rate+Measurements+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR.</a> J Vis Exp. (108), e53548(2016).</li>
<li>Liu, M., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+measurements+of+nonpermeating+compounds+in+live+cells+using+hyperpolarized+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic measurements of nonpermeating compounds in live cells using hyperpolarized NMR.</a> Anal Chem. 90 (2), 1217-1222 (2018).</li>
<li>Sannelli, F., Jensen, P. R., Meier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+NMR+approach+for+real-time+exploration+of+pathway+versatility%3A+substrate+mixtures+in+nonengineered+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">In-cell NMR approach for real-time exploration of pathway versatility: substrate mixtures in nonengineered yeast.</a> Anal Chem. 95 (18), 7262-7270 (2023).</li>
<li>Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+hyperpolarized+13C1-pyruvate+transport+and+metabolism+in+living+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (43), 18131-18136 (2009).</li>
<li>Rao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%5B1-13C%5Dpyruvate-to-%5B1-13C%5Dlactate+conversion+is+rate-limited+by+monocarboxylate+transporter-1+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized [1-13C]pyruvate-to-[1-13C]lactate conversion is rate-limited by monocarboxylate transporter-1 in the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 117 (36), 22378-22389 (2020).</li>
<li>Mathiassen, T. B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+13C+NMR+for+longitudinal+in-cell+metabolism+using+a+mobile+3D+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson+Open%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized 13C NMR for longitudinal in-cell metabolism using a mobile 3D cell culture system.</a> J Magn Reson Open. 16 - 17 (100131), 100131(2023).</li>
<li>Meier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+13C+NMR+reveals+pathway+regulation+in+Lactococcus+lactis+and+metabolic+similarities+and+differences+across+the+tree+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized 13C NMR reveals pathway regulation in Lactococcus lactis and metabolic similarities and differences across the tree of life.</a> Molecules. 29 (17), 4133(2024).</li>
<li>Sriram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bacteria-specific+metabolism+using+hyperpolarized+%5B2-13C%5Dpyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of bacteria-specific metabolism using hyperpolarized [2-13C]pyruvate.</a> ACS Infect Dis. 4 (5), 797-805 (2018).</li>
<li>Park, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+sodium+%5B1-13C%5D-glycerate+as+a+probe+for+assessing+glycolysis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized sodium [1-13C]-glycerate as a probe for assessing glycolysis in vivo.</a> J Am Chem Soc. 139 (19), 6629-6634 (2017).</li>
<li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+carbohydrate+metabolism+using+hyperpolarized+13C-labeled+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Probing carbohydrate metabolism using hyperpolarized 13C-labeled molecules.</a> NMR Biomed. 32 (10), e4018(2019).</li>
<li>Bohndiek, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%5B1-13C%5D-ascorbic+and+dehydroascorbic+acid%3A+vitamin+C+as+a+probe+for+imaging+redox+status+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized [1-13C]-ascorbic and dehydroascorbic acid: vitamin C as a probe for imaging redox status in vivo.</a> J Am Chem Soc. 133 (30), 11795-11801 (2011).</li>
<li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+insight+into+in+vivo+redox+status+utilizing+hyperpolarized+%5B1-13C%5D+N-acetyl+cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Real-time insight into in vivo redox status utilizing hyperpolarized [1-13C] N-acetyl cysteine.</a> Sci Rep. 11 (1), 12155(2021).</li>
<li>Düwel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+pH+in+vivo+using+hyperpolarized+13C-labelled+zymonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled zymonic acid.</a> Nat Commun. 8 (1), 15126(2017).</li>
<li>Chen, J., Hackett, E. P., Singh, J., Kovács, Z., Park, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+assessment+of+intracellular+and+extracellular+pH+using+hyperpolarized+%5B1-13C%5Dalanine+ethyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous assessment of intracellular and extracellular pH using hyperpolarized [1-13C]alanine ethyl ester.</a> Anal Chem. 92 (17), 11681-11686 (2020).</li>
<li>Eills, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+hyperpolarization+in+modern+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Spin hyperpolarization in modern magnetic resonance.</a> Chem Rev. 123 (4), 1417-1551 (2023).</li>
<li>Keshari, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+13C+spectroscopy+and+an+NMR-compatible+bioreactor+system+for+the+investigation+of+real-time+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized 13C spectroscopy and an NMR-compatible bioreactor system for the investigation of real-time cellular metabolism.</a> Magn Reson Med. 63 (2), 322-329 (2010).</li>
<li>Sriram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+hyperpolarized+lactate+production+and+efflux+as+a+biomarker+of+tumor+aggressiveness+in+an+MR+compatible+3D+cell+culture+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of hyperpolarized lactate production and efflux as a biomarker of tumor aggressiveness in an MR compatible 3D cell culture bioreactor.</a> NMR Biomed. 28 (9), 1141-1149 (2015).</li>
<li>Mangas-Florencio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DIY+bioreactor+for+in+situ+metabolic+tracking+in+3D+cell+models+via+hyperpolarized+13C+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A DIY bioreactor for in situ metabolic tracking in 3D cell models via hyperpolarized 13C NMR spectroscopy.</a> Anal Chem. 97 (3), 1594-1602 (2025).</li>
<li>Hill, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+free+approach+to+kinetic+analysis+of+real-time+hyperpolarized+13C+magnetic+resonance+spectroscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Model free approach to kinetic analysis of real-time hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy data.</a> PLoS One. 8 (9), e71996(2013).</li>
<li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C-MR+spectroscopic+imaging+with+hyperpolarized+%5B1-13C%5Dpyruvate+detects+early+response+to+radiotherapy+in+SCC+tumors+and+HT-29+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">13C-MR spectroscopic imaging with hyperpolarized [1-13C]pyruvate detects early response to radiotherapy in SCC tumors and HT-29 tumors.</a> Clin Cancer Res. 21 (22), 5073-5081 (2015).</li>
<li>Sengupta, D., Pratx, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+metabolic+heterogeneity+in+cancer%3A+from+PET+to+hyperpolarized+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Imaging metabolic heterogeneity in cancer: from PET to hyperpolarized MRI.</a> Mol Cancer. 15, 43(2016).</li>
<li>Read, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+alginate+hydrogels+for+radiobiological+and+metabolic+studies+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional alginate hydrogels for radiobiological and metabolic studies of cancer cells.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 171, 197-204 (2018).</li>
<li>Meier, S., Jensen, P. R., Karlsson, M., Lerche, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+NMR+probes+for+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized NMR probes for biological assays.</a> Sensors. 14 (1), 1576-1597 (2014).</li>
<li>Kondo, Y., Nonaka, H., Takakusagi, Y., Sando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+nuclear+magnetic+resonance+molecular+probes+for+hyperpolarized+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Design of nuclear magnetic resonance molecular probes for hyperpolarized bioimaging.</a> Angew Chem Int. Ed. 60 (27), 14779-14799 (2021).</li>
<li>Milani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+magnetic+tunnel+to+shelter+hyperpolarized+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">A magnetic tunnel to shelter hyperpolarized fluids.</a> Rev Sci Instrum. 86 (2), 024101(2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>[1-13C] חומצה פירובית</td><td>מעבדות קיימברידג' איזוט בע"מ</td><td>CLM-8077</td><td></td></tr><tr><td>מדפסת תלת מימד</td><td>אלגואו</td><td>שבתאי 2</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>נקלאי טסקה, בע"מ</td><td>06729-55</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>ערכת זרימה חיצונית למשאבה</td><td>כאחד</td><td>1-4141-02</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ג'יבקו</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>סט אביזרים ללא אוגן</td><td>GL Sciences בע"מ</td><td>6010-46390</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית עם ליבה</td><td>נארישיגה</td><td>GDC-1.5</td><td>קוטר פנימי ~0.9 מ"מ, אורך 90 מ"מ</td></tr><tr><td>משאבת מחזור מגנטית</td><td>כאחד</td><td>1-4141-01</td><td></td></tr><tr><td>מסטרנובה</td><td>מחקר Mestrelab</td><td></td><td>תוכנה לעיבוד וניתוח ספקטרלי של NMR</td></tr><tr><td>מזרק הזריקה שלי</td><td>תאגיד ניפרו</td><td>8277</td><td>0.5 מ"ל/100U, 30G x 10 מ"מ, 140 יח'</td></tr><tr><td>OX063</td><td>&nbsp; אוקספורד אינסטרומנטס בע"מ&nbsp; ו-Polarize IVS Co. Ltd.&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת הצצה</td><td>כאחד</td><td>3-780-05</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>נקלאי טסקה, בע"מ</td><td>26252-94</td><td></td></tr><tr><td>משאבת ביו מיני פריסטלטית</td><td>אטו</td><td>1221200</td><td>דיוק גבוה, סוג קצב זרימה רחב לזרימה בינונית יציבה</td></tr><tr><td>שרף</td><td>סיראיה טק</td><td>שחור מעושן</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 בינוני</td><td>נקלאי טסקה, בע"מ</td><td>30264-85</td><td></td></tr><tr><td>מחיצת בקבוקון סיליקון / PTFE</td><td>GL Sciences בע"מ</td><td>1030-50009</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אלגינט 80-120</td><td>FUJIFILM Wako תאגיד כימיקלים טהור</td><td>194-13321</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת SPINit</td><td>RS2D</td><td></td><td>תוכנת NMR במקטב DNP</td></tr><tr><td>ספוג</td><td>-</td><td>-</td><td>ספוג זמין מסחרית חתוך לגודל לייצוב ג'ל</td></tr><tr><td>סטוקוק תלת כיווני</td><td>כאחד</td><td>3-6247-04</td><td></td></tr><tr><td>טופספין</td><td>ברוקר</td><td></td><td>תוכנה לאיסוף ועיבוד נתוני NMR</td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.25%)</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>07086-74</td><td></td></tr><tr><td>שרף הניתן לריפוי UV</td><td>בונדיק</td><td>BD-SKCJ</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>כאחד</td><td>1-5832-41</td><td>רובוט תרמי מסדרת TR-1 ואלפא; לשמירה על 37 מעלות; טמפרטורת C</td></tr><tr><td>וילמד צינור NMR עם מכסה בורג</td><td>סיגמא</td><td>Z271977</td><td>תדר 400 מגה-הרץ, קוטר 10 מ"מ, L 178 מ"מ.</td></tr></tbody></table>

זיהוי מטבולי בזמן אמת בתאים חיים באמצעות תמ"ג היפרפולרי 13c

Real-Time Metabolic Detection in Living Cells Using Hyperpolarized 13C NMR

במחקר זה, מערכת מפוברקת חוברה לספקטרוסקופיה היפרפולרית של 13C NMR כדי למדוד את חילוף החומרים של פירובט בתאים חיים בזמן אמת. האותות העיקריים שזוהו בספקטרום 1D 13C NMR תאמו לפירובט (כ-171 ppm) ולקטט (כ-183 ppm)21, מה שמאפשר לנו להעריך את ההמרה המטבולית של פירובט ללקטט בתנאים פיזיולוגיים (איור 4).
איכות ספקטרלית ודינמיקת אותות תוצאות מייצגות ממדידות חוזרות ונשנות על אותה דגימה באמצעות תאי SCCVII - קו קרצינומה של תאי קשקש של עכבר המשמש לעתים קרובות במחקרי MRI היפרפולריזציה - מוצגות באיור 5. המדידה הראשונה הראתה עלייה ברורה באות הלקטט, מה שמעיד על המרה מטבולית פעילה. עם זאת, מדידות עוקבות שנלקחו במרווחים של 1.5 שעות הראו ירידה הדרגתית בפעילות המטבולית. הפחתה תלוית זמן זו משקפת ככל הנראה מתח ביולוגי או הסתגלות הנגרמת על ידי הזרקת הפירובט הראשונית. יש לציין כי אפנון מטבולי חולף דומה דווח in vivo באמצעות MRI ו-EPRI היפרפולריזציה, כאשר חמצון הגידול ירד באופן זמני לאחר מתן פירובט22. תוצאות אלה מדגימות כי יכולת החזרה של מדידות אלה מאפשרת מעקב לא הרסני אחר שינויים מטבוליים דינמיים - יתרון שקשה להשיג בשיטות הרסניות23.
כדי להעריך את הישימות של פרוטוקול זה על סוגי תאים אחרים, נערכו מדידות נוספות באמצעות תאי HeLa, קו תאי סרטן אנושי בשימוש נרחב. כפי שמוצג באיור 6, תאי HeLa הציגו גם המרה ברורה של פירובט ללקטט. למרות שעוצמת האות ירדה בהדרגה עקב הרפיית T1, יחס האות לרעש נשאר מספיק לאורך כל תקופת הרכישה של 60 שניות. ממצאים אלה מצביעים על כך שהפרוטוקול הנוכחי ישים באופן נרחב ויכול לשמש ככלי רב-תכליתי לפרופיל מטבולי בזמן אמת בסוגי תאים שונים.
בעוד שדעיכת אות מהירה היא מגבלה אינהרנטית של NMR מבוסס DNP, מערכת הערבוב באתרה שלנו ממזערת את העיכוב בין פירוק למדידה, ובכך משפרת את רגישות הזיהוי. שיפורים נוספים, כגון אופטימיזציה של הרכב מטריצת הג'ל, עשויים להרחיב את הישימות של שיטה זו למגוון רחב יותר של מערכות ביולוגיות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig1.jpg"> 
איור 1: דיאגרמה סכמטית של זרימת העבודה הכוללת מתרבית תאים ועד למדידת תמ"ג היפר-פולריזציה. התהליך מתחיל בתרבית תאים (~2 שבועות), ואחריה הכנת ג'ל אלגינט (~60 דקות) כדי לעטוף תאים למדידה יציבה. לאחר מכן, היפרפולריזציה מתבצעת באמצעות מערכת מקטב DNP (~60 דקות), ומדידת NMR מתבצעת באמצעות ספקטרומטר NMR של 400 מגה-הרץ (~5 דקות). התצלומים מימין מציגים את המכשירים המתאימים המשמשים בתהליך עבודה זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig2.jpg"> 
איור 2: מערך ביו-ריאקטור למדידת תמ"ג היפר-פולריזציה. (A) תרשים סכמטי של מערך הביוריאקטור. מדיום התרבות מוחדר לצינור ה-NMR דרך כניסה A ולאחר מכן מופנה לפסולת. חרוזי אלגינט המכילים תאים חיים ממוקמים בתוך צינור ה-NMR. במהלך מדידות NMR היפרפולריזציה, הגשושית ההיפרפולרית מוזרקת דרך כניסה B, המסומנת ככניסת בדיקה היפרפולריזציה. (ב) תצלום של כל מערך הביוריאקטור, עם צינורות הכניסה והיציאה מסומנים בבירור. (C) מבט מקרוב על מתג צינור הכניסה, שמראה כניסה A (זלוף בינוני) וכניסה B (הזרקת בדיקה היפרפולריזציה). (D) עיצוב CAD ו-(E) תצלום מייצג של רכיב קיבוע הספוג המודפס בתלת מימד הממוקם בתוך צינור ה-NMR. הרכיב כולל חור להנחיית נימי זכוכית המספקים את תמיסת המצע ההיפר-פולריזציה ופלטפורמה להחזקת ספוג. הרכיב עצמו אינו מתאים היטב לקיר הפנימי של צינור ה- NMR; (F) במקום זאת, מוכנס ספוג סביבו כדי למלא את החסר. מבנה זה מייצב את הרכיב ומאפשר למדיום הפסולת לזרום כלפי מעלה דרך הספוג, ומבטל את הצורך בחור יציאה נוסף. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig3.jpg"> 
איור 3: הכנת ג'ל אלגינט. (A) איור סכמטי ו-(B) תצלום של מנגנון היווצרות כדור ג'ל אלגינט. התמונה השמאלית מציגה את כל המערך, כולל צינור הצנטריפוגה עם מזרק קבוע למכסה השונה שלו. התמונה הימנית העליונה מציגה מכסה עם חור קטן לקצה המזרק, בעוד שהתמונה הימנית התחתונה מציגה מכסה עם פתח מרובע למיקום יציב של המזרק. צינור הצנטריפוגה ממולא מראש ב-10 מ"ל של תמיסת סידן כלוריד, מה שמאפשר לתמיסת האלגינט היוצאת מקצה המזרק לעבור ג'לציה, ויוצרת כדורי ג'ל אלגינט. (C) תמונה מיקרוסקופית מייצגת שמראה את המורפולוגיה של כדורי ג'ל אלגינט. (D) תמונה מיקרוסקופית מייצגת שמראה את המורפולוגיה של כדורי ג'ל אלגינט שמכילים תאי HeLa. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig4.jpg"> 
איור 4: ייצוג סכמטי של שלבי ההכנה למדידת תמ"ג והיפרפולריזציה. במהלך תהליך הצטברות ה-DNP של ~60 דקות, הגדרת ה-NMR מתבצעת במקביל כדי למזער עיכובים. ההכנה כוללת העמסת חרוזי אלגינט לתוך צינור ה-NMR, ואחריה כוונון נעילה של 1H, שימינג וכוונון בדיקה כדי להבטיח שהמערכת מוכנה למדידה מיידית. לאחר פירוק וערבוב באתר , ספקטרוסקופיה של 13C NMR שנפתרה בזמן חושפת פסגות פירובט ולקטט ברורות. הפסגות שנצפו בכ-171 ppm, 179 ppm ו-183 ppm תואמות לפירובט, פירובט הידרט ולקטט, בהתאמה. כ-4 × 107 תאי HeLa עטופים בג'ל אלגינט שימשו למדידת ה-NMR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig5.jpg"> 
איור 5: גילוי בפתרון זמן של אותות פירובט ולקטט במדידות חוזרות. ספקטרום תמ"ג 13C היפרפולרי של אותה דגימה עטופה בתאי SCCVII נרכשו במרווחים של 1.5 שעות כדי להעריך את ההיתכנות של מדידות חוזרות ולא הרסניות. פירובט (עיגולים פתוחים) ולקטט (עיגולים מלאים, בקנה מידה של 1000×) עוצמות שיא משורטטות לאורך זמן עבור כל רכישה. (א) מדידה ראשונה. (B) המדידה השנייה, אחרי שעה וחצי, מגלה ירידה ניכרת בייצור הלקטט. (C) המדידה השלישית, אחרי שעה וחצי נוספות, אישרה פעילות מטבולית נמוכה מתמשכת. ניתוח כמותי המבוסס על השטח שמתחת לעקומה (AUC) הראה כי היחס [לקטט]/[פירובט] ירד מ-0.00134 (מדידה ראשונה) ל-0.00019 (מדידה שנייה) ו-0.00027 (שלישית). ריכוז התאים הסופי בג'ל האלגינט היה כ-1.0 ×-107 תאים/מ"ל (4 ×-10-7 תאים ב-4 מ"ל). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig6.jpg"> 
איור 6: המרה של פירובט ללקטט בתאי HeLa. אותות תמ"ג היפרפולריים שנפתרו בזמן של פירובט ולקטט נמדדו בתאי HeLa חיים. עוצמת אות הפירובט מנורמלת לערכו המקסימלי בזמן אפס. עוצמת אות הלקטט מוגדלת בפקטור של 103 לצורך נראות. ניתוח כמותי המבוסס על השטח שמתחת לעקומה (AUC) הראה יחס [לקטט]/[פירובט] של 0.00121. ריכוז התאים הסופי בג'ל האלגינט היה כ-7.5 ×-106 תאים/מ"ל (3 ×-10-7 תאים ב-4 מ"ל). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a> 
איור משלים 1. תמונות מייצגות של מחיצת הבקבוקון המשמשת במערכת הביוריאקטור. (A) מחיצת סיליקון/PTFE (קוטר 9 מ"מ) לפני השימוש. (B) אותה מחיצה בשימוש בפועל, עם צינורות הצצה המוחדרים דרך חורים מנוקבים. האלסטיות של חומר המחיצה מאפשרת לו לאטום מחדש סביב הצינור, תוך שמירה על תנאים אטומים במהלך הזרקת מצע היפרפולריזציה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S1.tif" target="_blank">לחץ כאן להורדת איור זה</a>
איור משלים 2: ספקטרום תמ"ג 13C היפרפולרי שנפתר בזמן נרכש לאחר ערבוב חיצוני. ספקטרום מייצג שנפתר בזמן של מטבוליזם פירובט [1-13C] נמדד באמצעות מערכת NMR שולחנית לאחר ערבוב חיצוני של פירובט היפרפולרי ותאים מחוץ לצינור ה-NMR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S2_RE.tif" target="_blank">לחץ כאן להורדת איור זה</a>
קובץ משלים 1: עיצוב CAD של המחזיק הגלילי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Supplementary%20file%201_RE.ipt" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה</a>

זיהוי מטבולי בזמן אמת בתאים חיים באמצעות תמ"ג היפרפולרי 13C

The protocol presents a method to integrate an in-house-built bioreactor system with hyperpolarized 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to ...

real-time-metabolic-detection-living-cells-using-hyperpolarized-13c

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיפור הרגישות המסופק על ידי קיטוב גרעיני דינמי של פירוק (DNP) מאפשר מעקב אחר תהליכים מטבוליים בזמן אמת על ידי NMR ו-MRI. נדונים המאפיינים והביצועים של מערך DNP ייעודי לפירוק המיועד לחקר תגובות אנזימטיות.

פירוק דינמי גרעיני קיטוב Instrumentation מדידות קצב התגובה האנזימטית בזמן אמת על ידי התמ&quot;ג

פנטום דינמי רב-תאים משמש לדמות ביולוגיה מעניינת למחקרים מטבוליים באמצעות סוכני תהודה מגנטים היפר-פולריזציה.

שימוש פנטום אנזים יחיד דינמי רב-תא ללימודים של סוכני תהודה מגנטית Hyperpolarized

קיטוב גרעיני דינמי עם פירוק הדגימה שלאחר מכן איפשר מחקרים בזמן אמת של חילוף חומרים במערכות ביולוגיות. היפרפולריזציה [1-13C] פירובט שימשה לחקר פעילות לקטט דהידרוגנאז בקו תאי קרצינומה של הערמונית במבחנה.

Hyperpolarized 13 ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית מטבולית C והדמיה

אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד את התלות בשדה המגנטי של זמן ההרפיה של רשת הסחרור של 13C-תרכובות מועשר, היפרקוטביות באמצעות פולריזציה גרעינית דינמית, תוך שימוש במהירות מהירה על אופניים בשדה. באופן ספציפי, הדגמנו את זה עם הפירובט [1-13ג], אבל הפרוטוקול יכול להיות מורחב לשני מצעים היפרקוטב אחרים.

מדידת רשת ספין-סריג הרפיה השדה המגנטי של היפרקוטב [1-13ג] פיבט

פרוטוקול זה מתאר את ההתקנה של bioreactor NMR כדי לשמור על תאים אנושיים אנקפסולציה קיימא עבור עד 72 שעות, ואחריו זמן נפתר בתוך התא NMR נתונים וניתוח. המתודולוגיה מוחלת כדי לפקח על אינטראקציות חלבון-ליגנד תאיות בזמן אמת.

ניטור אינטראקציות חלבון-ליגנד בתאים אנושיים על ידי NMR כמותי בזמן אמת בתוך התא באמצעות Bioreactor צפיפות תאים גבוהה

אנו מתארים מערך ניסיוני לניהול מטבוליטים היפרפולריים 13בעלי תווית C במצב זילוח רציף ללב עכבר מבודד ומחורר. גישה ייעודית לרכישת 13C-NMR אפשרה לכמת את פעילות האנזים המטבולי בזמן אמת, וניתוח מולטי-פרמטרי של 31P-NMR איפשר לקבוע את תכולת ה-ATP וה-pH של הרקמה.

חקירת חילוף החומרים הלבבי בלב עכבר מבודד עם היפרפולריזציה [1-13C] פירובט וספקטרוסקופיית NMR 13C/31P

דימות פלואורסצנטי חיים (FLIM) התפתחה הטכניקה מפתח לתמונה הסביבה ואינטראקציה של חלבונים ספציפיים צבעים בתאים חיים. FLIM של רוטורים מולקולאריים ניאון מאפשר מיפוי של צמיגות בתאים חיים.

חיים דימות פלואורסצנטי של הרוטורים מולקולרית בתאים חיים

פיתחנו cytometer הזרימה באמצעות אולטרסאונד לייזר המושרה לזהות במחזור בתאי מלנומה אינדיקטור מוקדם של מחלה גרורתית.

איתור בידוד של תאים מלנומה במחזור באמצעות Flowmetry photoacoustic

מסמך זה מדגים פרוטוקול כדי לאפיין את התכונות מכאניות של תאי חיים באמצעות microindentation באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה למיקרוסקופ פלואורסצנטי שני צבעים ליצור רצפי תמונה בזמן אמת עם רזולוציה אופטית ובזמן חריג, דרישה של מבחני תא חי מסוימים, לרבות מבחני זרימת צלחת קאמרית הידבקות מקבילות. כאשר תוכנה היא מועסק למזג תמונות מערוצי פליטה רכשו בו זמנית, רצפי תמונת pseudocolored מיוצרים.

במקביל לכידת תמונות בזמן אמת בשני ערוצי פליטה באמצעות מערכת פיצול כפולה מצלמה פליטה: יישומים לסלולריים הידבקות

למד מעקב מטבולי בזמן אמת בתאים חיים באמצעות תמ"ג היפרפולרי ¹³C. פרוטוקול זה משלב ביוריאקטור מותאם עם ספקטרוסקופיית NMR לבחינת מטבוליזם פירובט ויישומי סקרינג תרופות.

זיהוי מטבולי בזמן אמת בתאים חיים באמצעות תמ"ג היפרפולרי ¹³C

גלה סרטונים נוספים