זיהוי מטבולי בזמן אמת בתאים חיים באמצעות תמ"ג היפרפולרי ¹³C

פיתחנו שיטה לא פולשנית למדידת חילוף חומרים בסרום בזמן אמת באמצעות טכניקות NMR היפרפולריות מתקדמות. מטרתנו היא ליצור כלים נגישים ליישומי מחקר ביולוגיים שונים. דווח על מספר מערכות NMR היפרפולריות למטבוליזם בסרום. עם זאת, פרוטוקולים סטנדרטיים וניתנים לשחזור ליישום מחקר רחב יותר לא היו זמינים עד כה.

הפרוטוקול שלנו משפר את הנגישות באמצעות רכיבים מסחריים זמינים. אנו מספקים גם ולידציה מקיפה, כולל יתרונות ערבוב מערכות ויכולות מדידה חוזרות להתאמה רחבה יותר. התוצאות שלנו מאפשרות מעקב בזמן אמת אחר שינויים מטבוליים דינמיים בתאים חיים ללא הסחות דעת. זה פותח אפשרויות חדשות למחקרי תרופות ארוכי טווח ביישומי בדיקות מטבוליות מגוונות.

לגישה שלנו יש מגבלות, כולל אפשרויות בדיקה ודרישות אוטומציה. פתרון האתגרים יבסס טכניקות מדידה מטבוליות תאיות ויעשיר את מאמצי מחקר ה-DNP של המעבדה שלנו בעתיד.

[קריין] כדי להתחיל, הוסף שני מיליליטר של 0.25% נפח לנפח תמיסת טריפסין EDTA לכלי של 10 סנטימטר. הטה את המנה בעדינות כדי להבטיח שכל המשטח מכוסה. לאחר מכן שאפו את עודף תמיסת החומצה הטריפסין אתילנדיאמין-טראסטית. מניחים את המנה באינקובטור המוגדר על 37 מעלות צלזיוס ומדגרים במשך שתי דקות. לאחר מכן מוסיפים 10 מיליליטר מדיום תרבות לתבשיל. בעזרת פיפטה, פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים מהמשטח ולאסוף את כל תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. כעת קח כ-10 מיקרוליטר מתרחיף התאים והעמיס אותו למונה תאים כדי לקבוע את מספר התאים. ודא שהספירה הנמדדת מאשרת תפוקה של כ-10 מיליון תאים או התאם לפי הצורך. צנטריפוגה את תרחיף התאים הנותר ב -120 x גרם למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה, יש לשאוף ולהשליך את הסופרנטנט. השעו מחדש את גלולת התא המתקבלת בארבעה מיליליטר של תמיסת אלגינט במשקל לנפח של 2%, ופיפטה לאט כדי למזער את היווצרות הבועה. כעת הוסף 10 מיליליטר של תמיסת סידן כלוריד של 50 מילי-מולרית לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. אבטח את המזרק למכסה של צינור הצנטריפוגה המכיל תמיסת סידן כלורי. שאב 300 מיקרוליטר מתערובת האלגינט של התא למזרק של 0.5 מיליליטר המצויד במחט של 10 מילימטר. לאחר מכן סגור את צינור הצנטריפוגה בחוזקה כשהמזרק מקובע למכסה, והנח את המכלול בצנטריפוגה כדי להסתובב בעדינות ב -200 x גרם למשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה והשהה מחדש את הג'ל שנוצר במדיום תרבית. לאחר מכן, בעזרת פיפטה של פסטר, העבירו את הג'ל העטוף בתא לתוך צינור NMR והכנסו את מתקן הספוג כדי להבטיח אטימה הדוקה. מחממים מראש את המאגר הבינוני המכיל 5% תחמוצת דאוטריום בנפח לנפח באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. התחל במחזור בקצב של כ -500 מיקרוליטר לשעה כדי לייצב את התנאים. בדוק את ההתקנה כדי לוודא שאין נזילות לפני שתמשיך. הוסף 18 מיקרוליטר של חומצה פירובית עם תווית פחמן 13 בריכוז של 14.2 מולרית מסוממת עם 25 מילי-מולרית OX063 לבקבוקון דגימה. חבר את הבקבוקון לנתיב הנוזל של מערכת המקטב הדינמית של הקיטוב הגרעיני. לאחר מכן, הכנס את הבקבוקון המחובר ליחידת הקידוח של המקטב הגרעיני הדינמי. הפעל קרינת מיקרוגל בכ-188 ג'יגה-הרץ בהספק של 22 מילי-וואט למשך 60 עד 80 דקות. השתמש בספקטרומטר התהודה המגנטית הגרעינית במצב מוצק המשולב במערכת הקיטוב הגרעינית הדינמית כדי לנטר את עוצמת האות של פחמן 13. רשום את נתוני האות כל חמש דקות באמצעות תוכנת בקרת המערכות. כעת ממיסים במהירות את הדגימה המקוטבת ב-3.2 מיליליטר של מאגר פירוק שחומם מראש לטמפרטורה ביולוגית. טען את הדגימה המוכנה לתוך צינור NMR והכנס את הצינור לספקטרומטר. בקונסולת ה-NMR, התחל את ההליך האוטומטי לביצוע נעילה, כוונון, התאמה והחלקה עם הדגימה במקומה כדי להבטיח רזולוציה ספקטרלית אופטימלית ויציבות אות. טען רצף רכישת דופק פחמן 13 עם ניתוק פרוטונים המופעל באמצעות הגדרה כמו 13-CPD. הגדר את זווית ההיפוך ל-90 מעלות עם דופק של מיקרו-שנייה אחד המסומן כ-P1. לאחר מכן, הגדירו את זמן הרכישה כ-1.376 שניות, רוחב ספקטרלי כ-23,663 הרץ, ונקודות רכישה, או TD, כ-65,536. הגדר את עיכוב ההרפיה D1 לאפס שניות. הקצה מרווחי זמן של 150 ל-TD1 לרכישת 150 ספקטרום רציף במצב פסאודו-2 ממדי, והתאם את רווח המקלט לערך נמוך, כגון בערך אחד, כדי למנוע רוויית אות הנגרמת על ידי הדגימות ההיפר-פולריות. כעת עצור את המשאבה הפריסטלטית כדי לעצור זמנית את זרימת המדיום לפני הזרקת התמיסה ההיפרפולרית דרך צינור הכניסה. התחל את הרכישה הספקטרלית כ-10 שניות לפני המסת המצע ההיפר-קוטבי כדי להבטיח לכידת אות עם ההגעה לאתר הזיהוי. כאשר התמיסה יוצאת מהמקטב הדינמי של הקיטוב הגרעיני, משוך מיליליטר אחד ממנו למזרק. העבר את השסתום התלת-כיווני בכניסת הביוריאקטור למצב B כדי לכוון את התמיסה ההיפר-פולרית לתוך צינור ה-NMR. לאחר השלמת ההזרקה, החזר את השסתום למצב A כדי לחדש את זרימת הדם הבינונית ולמנוע זרימה חוזרת. לבסוף, ודא שההזרקה הצליחה לאחר שציין עלייה באות דעיכת האינדוקציה החופשית בתוכנת הרכישה. ודא שהתמיסה הסופית מגיעה לטמפרטורה שבין 308 ל-313 קלווין ו-pH של כשבע לפני ההעברה למדידת NMR. ספקטרום תמ"ג פחמן 13 היפרפולריזציה של אותה דגימה עטופה בתאי SCCVII נרכשו במרווחים של 1.5 שעות כדי להעריך את ההיתכנות של מדידות חוזרות ונשנות שאינן הרסניות. מדידת ה-NMR הראשונה הראתה אות לקטט מוגבר באופן ניכר, מה שמצביע על המרה מטבולית פעילה של פירובט ללקטט. מדידות עוקבות במרווחים של 1.5 שעות חשפו ירידה הדרגתית בעוצמת אות הלקטט, מה שמעיד על ירידה בפעילות המטבולית לאורך זמן. בתאי HeLa, מדידות ראשוניות אישרו המרה מוצלחת של פירובט ללקטט עם שיאי אות ברורים. למרות שהאות ירד בהדרגה עקב הרפיית T2, יחס האות לרעש נשאר הולם לאורך כל הרכישה של 60 שניות, מה שמצביע על כך שהפרוטוקול הנוכחי ישים באופן נרחב ויכול לשמש ככלי רב-תכליתי לפרופיל מטבולי בזמן אמת בסוגי תאים שונים.