Name: שאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-Escherichia coli (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: חקור שיטה לשאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-Escherichia coli באמצעות כרומטוגרפיית זיקה וגודל. מתודולוגיה זו מאפשרת אפיון ביוכימי ומבני של Nsp15 לפיתוח מודל אבולוציוני ומטרות טיפוליות נגד נידו-וירוסים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Francis, D. M., Page, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+optimize+protein+expression+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies to optimize protein expression in E. coli.</a> Curr Protoc Protein Sci. 61 (1), 5.24.1-5.24.29 (2010).</li>
<li>Dumon-Seignovert, L., Cariot, G., Vuillard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxicity+of+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%3A+a+comparison+of+overexpression+in+BL21%28DE3%29%2C+C41%28DE3%29%2C+and+C43%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3).</a> Protein Expr Purif. 37 (1), 203-206 (2004).</li>
<li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Front Microbiol. 5, 1-17 (2014).</li>
<li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+Escherichia+coli+for+membrane+protein+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).</li>
<li>Kato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+low+leakage+expression+systems+using+dual+transcriptional-translational+control+for+toxic+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Extremely low leakage expression systems using dual transcriptional-translational control for toxic protein production.</a> Int J Mol Sci. 21 (3), 705(2020).</li>
<li>Dubendorf, J. W., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+basal+expression+in+an+inducible+T7+expression+system+by+blocking+the+target+T7+promoter+with+lac+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.</a> J Mol Biol. 219 (1), 45-59 (1991).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+lysozyme+to+improve+an+inducible+T7+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system.</a> J Mol Biol. 219 (1), 37-44 (1991).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).</li>
<li>Schlegel, S., Genevaux, P., de Gier, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De-convoluting+the+genetic+adaptations+of+E.+coli+C41%28DE3%29+in+real+time+reveals+how+alleviating+protein+production+stress+improves+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">De-convoluting the genetic adaptations of E. coli C41(DE3) in real time reveals how alleviating protein production stress improves yields.</a> Cell Rep. 10 (10), 1758-1766 (2015).</li>
<li>James, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+over-expression+in+Escherichia+coli+triggers+adaptation+analogous+to+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Protein over-expression in Escherichia coli triggers adaptation analogous to antimicrobial resistance.</a> Microb Cell Fact. 20 (1), 13(2021).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dimerization-dependent+mechanism+drives+the+endoribonuclease+function+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+nsp11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A dimerization-dependent mechanism drives the endoribonuclease function of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp11.</a> J Virol. 90 (9), 4579-4592 (2016).</li>
<li>Nedialkova, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+arterivirus+nonstructural+protein+11+reveals+the+nidovirus-wide+conservation+of+a+replicative+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of arterivirus nonstructural protein 11 reveals the nidovirus-wide conservation of a replicative endoribonuclease.</a> J Virol. 83 (11), 5671-5682 (2009).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+endoribonuclease+ensures+efficient+viral+replication+and+prevents+protein+kinase+R+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Coronavirus endoribonuclease ensures efficient viral replication and prevents protein kinase R activation.</a> J Virol. 95 (7), e02103-e02120 (2021).</li>
<li>Joseph, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+monomeric+form+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+endonuclease+nsp15+suggests+a+role+for+hexamerization+as+an+allosteric+switch%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a monomeric form of severe acute respiratory syndrome coronavirus endonuclease nsp15 suggests a role for hexamerization as an allosteric switch.</a> J Virol. 81 (12), 6700-6708 (2007).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+for+endoribonuclease+nsp15-mediated+regulation+of+alpha-coronavirus+propagation+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Diversity for endoribonuclease nsp15-mediated regulation of alpha-coronavirus propagation and virulence.</a> Microbiol Spectr. 11 (6), e02209-e02223 (2023).</li>
<li>Guarino, L. A., Bhardwaj, K., Dong, W., Sun, J., Holzenburg, A., Kao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+SARS+virus+nsp15+endoribonuclease%3A+identification+of+residues+affecting+hexamer+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the SARS virus nsp15 endoribonuclease: identification of residues affecting hexamer formation.</a> J Mol Biol. 353 (5), 1106-1117 (2005).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+antiviral+target+revealed+by+the+hexameric+structure+of+mouse+hepatitis+virus+nonstructural+protein+nsp15%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">New antiviral target revealed by the hexameric structure of mouse hepatitis virus nonstructural protein nsp15.</a> J Virol. 80 (16), 7909-7917 (2006).</li>
<li>Bhardwaj, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+analyses+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+endoribonuclease+nsp15%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural and functional analyses of the severe acute respiratory syndrome coronavirus endoribonuclease nsp15.</a> J Biol Chem. 283 (6), 3655-3664 (2008).</li>
<li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+SARS-CoV-2+endoribonuclease+nsp15+reveal+insight+into+nuclease+specificity+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics.</a> Nat Commun. 12 (1), 636(2021).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+nsp15+endoribonuclease+NendoU+from+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of nsp15 endoribonuclease NendoU from SARS-CoV-2.</a> Protein Sci. 29 (7), 1596-1605 (2020).</li>
<li>Chaga, G., Hopp, J., Nelson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+metal+ion+affinity+chromatography+on+Co2%2B+carboxymethylaspartate-agarose+Superflow%2C+as+demonstrated+by+one-step+purification+of+lactate+dehydrogenase+from+chicken+breast+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Appl+Biochem%22%5BJournal%5D)">Immobilized metal ion affinity chromatography on Co2+ carboxymethylaspartate-agarose Superflow, as demonstrated by one-step purification of lactate dehydrogenase from chicken breast muscle.</a> Biotechnol Appl Biochem. 29 (1), 19-24 (1999).</li>
<li>Cao, J., Wu, C. C., Lin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turkey+coronavirus+non-structure+protein+NSP15+-+an+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Turkey coronavirus non-structure protein NSP15 - an endoribonuclease.</a> Intervirology. 51 (5), 342-351 (2008).</li>
<li>Andersen, K. R., Leksa, N. C., Schwartz, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+E.+coli+expression+strain+LOBSTR+eliminates+common+contaminants+from+His-tag+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Optimized E. coli expression strain LOBSTR eliminates common contaminants from His-tag purification.</a> Proteins. 81 (11), 1857-1861 (2013).</li>
<li>Saida, F., Uzan, M., Odaert, B., Bontems, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+highly+toxic+genes+in+E.+coli%3A+special+strategies+and+genetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protein+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of highly toxic genes in E. coli: special strategies and genetic tools.</a> Curr Protein Pept Sci. 7 (1), 47-56 (2006).</li>
<li>Godoy, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+regulation+and+crystallographic+fragment+screening+of+SARS-CoV-2+nsp15+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Allosteric regulation and crystallographic fragment screening of SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 51 (10), 5255-5270 (2023).</li>
<li>Otter, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+nsp15+endoribonuclease+antagonizes+dsRNA-induced+antiviral+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease antagonizes dsRNA-induced antiviral signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (15), e2320194121(2024).</li>
<li>Wang, X., Zhu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+nsp15+preferentially+degrades+AU-rich+dsRNA+via+its+dsRNA+nickase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 nsp15 preferentially degrades AU-rich dsRNA via its dsRNA nickase activity.</a> Nucleic Acids Res. 52 (9), 5257-5272 (2024).</li>
<li>Zheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+evolution+of+nidovirus+endoribonuclease+based+on+the+finding+that+nsp15+from+porcine+deltacoronavirus+functions+as+a+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Insight into the evolution of nidovirus endoribonuclease based on the finding that nsp15 from porcine deltacoronavirus functions as a dimer.</a> J Biol Chem. 293 (31), 12054-12067 (2018).</li>
<li>Huang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+RNA+cleavage+by+coronavirus+nsp15+endonuclease%3A+evidence+for+acid-base+catalysis+and+substrate-dependent+metal+ion+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of RNA cleavage by coronavirus nsp15 endonuclease: evidence for acid-base catalysis and substrate-dependent metal ion activation.</a> J Biol Chem. 299 (6), 104787(2023).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+characterization+of+endoribonuclease+nsp15+encoded+by+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical characterization of endoribonuclease nsp15 encoded by Middle East respiratory syndrome coronavirus.</a> J Virol. 92 (22), e00893-e00918 (2018).</li>
<li>Jernigan, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+structural+studies+of+SARS-CoV-2+protein+NendoU+with+an+X-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Room-temperature structural studies of SARS-CoV-2 protein NendoU with an X-ray free-electron laser.</a> Structure. 31 (2), 138-151.e5 (2023).</li>
<li>Ricagno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+nsp15+from+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of nsp15 from SARS coronavirus.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Cryst Commun. 62 (4), 409-411 (2006).</li>
<li>Canal, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+SARS-CoV-2+antiviral+compounds+by+screening+for+small+molecule+inhibitors+of+nsp15+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identifying SARS-CoV-2 antiviral compounds by screening for small molecule inhibitors of nsp15 endoribonuclease.</a> Biochem J. 478 (13), 2465-2479 (2021).</li>
<li>Bhardwaj, K., Guarino, L., Kao, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+nsp15+protein+is+an+endoribonuclease+that+prefers+manganese+as+a+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The severe acute respiratory syndrome coronavirus nsp15 protein is an endoribonuclease that prefers manganese as a cofactor.</a> J Virol. 78 (22), 12218-12224 (2004).</li>
<li>De Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+successful+recombinant+expression+of+disulfide+bond-dependent+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-dependent proteins in Escherichia coli.</a> Microb Cell Fact. 8 (1), 26(2009).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.22 ומיקרו; m PES, סטריליזציה, כריכת חלבון נמוכה, מערכת סינון, 1 ליטר</td><td>קורנינג</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>מעכב סרין פרוטאז AEBSF</td><td>גולדביו</td><td>30827-99-7</td><td></td></tr><tr><td>אגר, בקטריולוגי</td><td>אמרסקו</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; מערכת טיהור KTA go</td><td>ציטיבה</td><td>29383015</td><td></td></tr><tr><td>רכז Amicon Ultra 15 מ"ל, 30 kDa MWCO</td><td>מיליפור</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין נתרן</td><td>גולדביו</td><td>א-301-25</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות טלטול מבולבלות</td><td>נלג'ין&nbsp;</td><td>F0527</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה ספסל</td><td>אפנדורף&nbsp;</td><td>5920R</td><td></td></tr><tr><td>ביופוטומטר פלוס</td><td>אפנדורף</td><td>E-BP6132</td><td></td></tr><tr><td>טרומבין בקר</td><td>ביופארם</td><td>91-030</td><td></td></tr><tr><td>מגיב צבע ברדפורד</td><td>בוסטון ביופרודקטס</td><td>BPA-200</td><td></td></tr><tr><td>כחול ברומופנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>114931</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>אמבטיה יבשה דיגיטלית</td><td>ביו ראד</td><td>1660562</td><td></td></tr><tr><td>מפזרים חד פעמיים, בצורת L</td><td>שותפי MedSupply</td><td>62-1014-1</td><td></td></tr><tr><td>דיתיותרייטול</td><td>גולדביו</td><td>27565-41-9</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI מלבלב בקר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>מטחנת רקמות דוס, 40 מ"ל</td><td>ויטון</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>עמודות כרומגטוגרפיה של עמודות חסכוניות</td><td>ביו-ראד</td><td>737-1532</td><td></td></tr><tr><td>מערבל אגוזים אנדורו מינימיקס</td><td>לבנט</td><td>S0600</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>אקסלה E25R Inc/Ref שייקר</td><td>אפנדורף</td><td>NB-E25R</td><td></td></tr><tr><td>FastPette V2</td><td>לבנט</td><td>עמ' 2000</td><td></td></tr><tr><td>רוטור זווית קבועה Fiberlite F10-4x1000 LEX</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>096-041075</td><td></td></tr><tr><td>רוטור זווית קבועה Fiberlite F21-8x50y</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>096-084275</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל דוק EZ Imager</td><td>ביו-ראד</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אלריך</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>ביו-ראד</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>הפס</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>בוחש פלטה חמה</td><td>VWR</td><td>12365-346</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>VWR</td><td>BDH3028</td><td></td></tr><tr><td>אימידזול</td><td>גולדביו</td><td>I-902-25</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל-&szlig;-D-תיוגלקטיוזיד (IPTG)</td><td>גולדביו</td><td>קוד 12481ג25</td><td></td></tr><tr><td>Lemo21(DE3) תאי E. coli מוכשרים</td><td>מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד</td><td>C2528J</td><td></td></tr><tr><td>מנגן (II) כלוריד טטרהידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה, 0.5 מ"ל</td><td>VWR</td><td>87003-290</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה, 1.7 מ"ל</td><td>שותפי MedSupply</td><td>15-1151</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה, 2 מ"ל</td><td>אקסיג'ן</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>תא אלקטרופורזה אנכי Mini-PROTEAN טטרה</td><td>ביו-ראד</td><td>10025025</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל מיני-פרוטאן טריס-גליצין, 4-20%</td><td>ביו-ראד</td><td>4568094</td><td></td></tr><tr><td>צנטרפוגה מיני MyFuge</td><td>שותפי MedSupply</td><td>C1008-B</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק צנטריפוגה סופר מהיר של Nalgene 1 ליטר</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>3141-1006</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה רכס אלון נלג'ין</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>31139-0050</td><td></td></tr><tr><td>ננופוטומטר</td><td>אימפלן</td><td>3769</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור שאינו רועד</td><td>לבנט</td><td>א 5110&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תאים בעלי יכולת כימית C41 (DE3) יתר על המידה</td><td>טכנולוגיות Biosearch</td><td>60442-1</td><td></td></tr><tr><td>תאים בעלי יכולת כימית C41 (DE3) יתר על המידה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CMC0017</td><td>הופסק; תאי Biosearch C41(DE3) או תאי NEB Lemo21 הם אלטרנטיבה</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>שותפי MedSupply</td><td>62-1077-3</td><td></td></tr><tr><td>פלסמידים (עמוד שדרה pET-14b)</td><td>ג'נסקריפט</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-קובטות פלסטיק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח PowerPacuniversal</td><td>ביו-ראד</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>מחט החלקה מדויקת</td><td>בקטון דיקסון</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>תקני דיוק פלוס חלבון ללא כתמים</td><td>ביו-ראד</td><td>1610363</td><td></td></tr><tr><td>אמצעי התאוששות לביטוי&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CMR0001K</td><td></td></tr><tr><td>רוטור דלי מתנדנד S-4x1000</td><td>אפנדורף</td><td>EP-S4X1</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית, 10 מ"ל</td><td>פאקלון</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית, 25 מ"ל</td><td>פאקלון</td><td>35725</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית, 5 מ"ל</td><td>פאקלון</td><td>35743</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית, 50 מ"ל</td><td>Pr1ma</td><td>PR-סרו-50</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>מפרק סוניק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB505</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה Sorvall Lynx 4000</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>75006580</td><td></td></tr><tr><td>עמודת Spephadex G-25 M PD-10</td><td>ציטיבה</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-מרקפטואתנול</td><td>מיליפור</td><td>444203</td><td></td></tr><tr><td>גריפין מפלדת אל-חלד</td><td>כלי קוטב</td><td>ברקוד 13977-010-EA</td><td></td></tr><tr><td>צינורות בז סטריליים, 15 מ"ל</td><td>בז</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>צינורות בז סטריליים, 50 מ"ל</td><td>בז</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>טור Superdex 200 10/300 GL</td><td>ציטיבה</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים, 1 מ"ל</td><td>אייר-טיט&nbsp;</td><td>א1</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים, 3 מ"ל</td><td>בקטון דיקסון</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>שרף זיקה מתכת TALON</td><td>טאקארה</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>קיסמים</td><td>רחוב היצירתיות</td><td>PAC3690-01</td><td></td></tr><tr><td>בסיס טריס</td><td>גולדביו</td><td>טי-400-1</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>MP ביומדיקל</td><td>807423</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>T60065</td><td></td></tr><tr><td>וורנדו</td><td>אמת מידה</td><td>BV101-G</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>Y20025</td><td></td></tr></tbody></table>

שאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-escherichia coli

Overexpressing and Purifying a Toxic Nuclease from Escherichia coli

בשל הרעילות של Nsp15 כנוקלאז, נדרשו בדרך כלל ~7 שעות כדי שתרביות ההתחלה יגיעו ל-OD600 של 0.8-1.0. לאחר החיסון, נדרשו בדרך כלל ~3-5 שעות לאותו OD600 אופטימלי של 0.8-1.0 לזירוז. במקרה זה, זמן ההכפלה נראה כ~1 שעה. כאשר התבטאה מוטציה קטליטית-מתה של Nsp15, ההכפלה של תאי E. coli נראתה נורמלית (~20 דקות), עדות נוספת לכך שפעילות הנוקלאז אחראית לרעילות (איור 1A).
לאחר השראת לילה, נקטפו בדרך כלל 6-9 גרם של כדור תאים במשקל רטוב לכל גידול של 2 ל...

שאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-Escherichia coli

Escherichia coli has been widely employed as an expression system to produce recombinant proteins. Yet some types of recombinant proteins, such as ...

overexpressing-and-purifying-a-toxic-nuclease-from-escherichia-coli

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

התמרה חלבון ומאפשרת העברה ישירה של חלבונים פעילים ביולוגית לתוך התאים. בניגוד לשיטות קונבנציונליות כגון transfection DNA נגיפי או התמרה זו פרדיגמה פולשנית מאפשרת מניפולציה הסלולר היעילה ביותר באופן titratable עקיפת רעילות הסלולר את הסיכון של שינוי בשעור על ידי הנדסה גנטית קבע.

הנדסה Cell-חדיר חלבון

(גני גן או epistasis) מסכים שיטתיים, בקנה מידה גדול סינטטיים גנטיים אינטראקציה יכולים לשמש כדי לחקור יתירות ומסלול-הצטלבות גנטית. כאן, אנו מתארים טכנולוגית תפוקה גבוהה כמותית סינטתית גנטית מערך הקרנה, כינת eSGA שפתחנו להבהרת יחסי epistatic ולחקור רשתות אינטראקציה גנטיות...

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

Exonucleases ממלאים תפקידים קריטיים בהבטחת יציבות הגנום. אובדן תפקוד האקסונוקלאז של WRN גורם להזדקנות מוקדמת. חקר מצעים ודרישות אחרות של הנוקלאז במבחנה יכול לעזור להבהיר את תפקידו in vivo. כאן אנו מדגימים בדיקה מבוססת פלואורסצנטית מהירה וניתנת לשחזור כדי למדוד את פעילות הנוקלאז שלו.

Assay exonuclease הקרינה מבוסס לאפיין DmWRNexo, Orthologue של האדם Progeroid WRN exonuclease, ויישומו nucleases אחר

פרוטוקול של חמישה ימים זה מתאר את כל השלבים, ציוד ותוכנה נוספת דרושה ליצירה והפעלת מערכת ביטוי תא ללא TX-TL מאפס חיידקי Escherichia אנדוגני יעילים מבוססים. עם חומרים כימיים, הפרוטוקול לוקח 8 שעות או פחות להגדרת תגובה, לאסוף, ולעבד נתונים.

פרוטוקולים ליישום חיידקי Escherichia בהתבסס TX-TL סלולרי ללא ביטוי של ביולוגיה סינתטית

ביטוי משותף של חלבונים הוא אלטרנטיבה רבת עוצמה לבנייה מחדש במבחנה של קומפלקסים של חלבונים, והוא מסייע בביצוע בדיקות ביוכימיות וגנטיות in vivo. כאן אנו מדווחים על השימוש בביטוי משותף של חלבונים ב-Escherichia coli כדי להשיג קומפלקסים של חלבונים, ולכוונן את תדירות המוטציות של התאים.

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em

שיטת תשואה גבוהה לטיהור שלילית חד-שלבית של רקומביננטי הליקובקטר פילורי חלבון ההפעלה-נויטרופילים (HP-NAP) ביתר coli Escherichia באמצעות שרפי diethylaminoethyl במצב תצווה מתואר. HP-NAP מטוהר בשיטה זו מועיל לפיתוח של חיסונים, תרופות, או אבחון עבור H. פילורי -associated מחלות.

צעד אחד טיהור זיהוי תכונות חומרים שלילית של<em&gt; הליקובקטר פילורי</em&gt; חלבון נויטרופילים-הפעלת ביתר<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; במצב אצווה

פרוטוקול פשוט overexpression וטיהור של קודון אופטימיזציה, CIS- perrenyltransferase אדם, בתנאים שאינם denaturing, מ Escherichia   Coli , מתואר, יחד עם assay פעילות אנזימטית. פרוטוקול זה ניתן להכליל לייצור של חלבונים אחרים cis- prenyltransferase בכמות ואיכות מתאים ללימודי מכניסטית.

Overexpression וטיהור האדם Cis פרנליטרונפרפרז ב Escherichia coli

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור השימוש קיימות מגירות עמידות לאנטיביוטיקה מחיקה בונה כבסיס ליצירת מוטציות מחיקה זנים אחרים e. coli . מוטציות מחיקה כאלה יכולים להיות גייסה ונוסף מיקומה המקביל של זן נמען באמצעות התמרה חושית bacteriophage P1.

הפקת ג'ין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

Protocatechuate 3, 4-דיחמצן (PCD) ניתן להסיר בחינם חמצן diאטומית ממערכת מימית באמצעות המצע שלה protocatechuic חומצה (PCD). פרוטוקול זה מתאר את הביטוי, הטיהור וניתוח הפעילות של אנזים ניקוי החמצן.

ביטוי וטיהור של Nuclease-מזבל החמצן חינם Protocatechuate 3, 4-דיחמצן

ניתן לפתח את הגבלת הגבלות עם ספציפיות רצף חדש מאנזימים המספרים על רצף מנוון באופן חלקי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט כי השתמשנו בהצלחה כדי לשנות את הספציפיות הרצף של האנזים NlaIV. מרכיבי המפתח של הפרוטוקול הם ממדר החוץ של התגובה שעתוק/תרגום ומבחר של משתנים עם משתני רצף חדש.

האבולוציה בבימויו של הגבלת מגבלות על הגבלה עם ספציפיות יותר מחמירות

חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

חקור שיטה לשאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-Escherichia coli באמצעות כרומטוגרפיית זיקה וגודל. מתודולוגיה זו מאפשרת אפיון ביוכימי ומבני של Nsp15 לפיתוח מודל אבולוציוני ומטרות טיפוליות נגד נידו-וירוסים.

שאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-Escherichia coli

גלה סרטונים נוספים