Overexpressing and Purifying a Toxic Nuclease from <em>Escherichia coli</em>

Erik J. Daquilanea; Meredith N. Frazier

doi:10.3791/68577

שאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-Escherichia coli

JoVE Journal
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biochemistry

Overexpressing and Purifying a Toxic Nuclease from Escherichia coli

שאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-Escherichia coli

Full Text

785 Views

08:13 min

August 29, 2025

DOI: 10.3791/68577-v

Erik J. Daquilanea¹, Meredith N. Frazier¹

¹Department of Chemistry and Biochemistry,College of Charleston

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לביטוי יתר של Nsp15 רקומביננטי, נוקלאז רעיל, במערכת ביטוי C41(DE3), ואחריה טיהור החלבון המתויג באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה והדרת גודל. ניתן להתאים את הפרוטוקולים האלה לחלבונים רעילים מאתגרים אחרים.

המעבדה שלנו שואפת לאפיין מבנית וביוכימית אנדונוקלאז משומר שנמצא בנידו-וירוסים, כולל וירוסי קורונה, כדי לפתח מודל אבולוציוני ולספק בסיס למטרות טיפוליות. נוקלאזות יכולות להיות קשות לביטוי במערכות E coli עקב פעילות אנזימטית על DNA או RNA תאי, מה שעלול לגרום לצמיחה איטית ולתפוקות חלבון ירודות. הממצא שלנו יאפשר לנו לטהר נוקלאזות רעילות מנידו-וירוסים אחרים למחקרים ביוכימיים ומבניים נוספים בהמשך הזרם.

כדי להתחיל, השתמש בבקבוק ארלנמאייר מעוקר אחד של 50 מיליליטר לכל ליטר תרבית והכין שתיים עד שלוש צלוחיות נוספות כתרביות מתחילות. סמן את אחת הצלוחיות בכוכב כדי לייעד אותה לבדיקת צפיפות אופטית, מכיוון שהמדידות שלה ייצגו את כל הגידול, אלא אם כן יש הבדל חזותי בין הצלוחיות. בעזרת גליל מדורג, הכינו תערובת מאסטר על ידי שילוב של 60 מיליליטר של 2X TY בינוני ו-60 מיקרוליטר של תמיסת מלאי אמפיצילין שהופשרה ממינוס 20 מעלות צלזיוס.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos