חילוץ היסטונים מדגימות קליניות לפרופיל אפיגנטי באמצעות ספקטרומטריית מסה

היקף המחקר שלנו הוא לנתח שינויים אפיגנטיים בדגימות סרטן, לגלות סמנים אבחנתיים ותחזיתיים חדשים, ולזהות יעד פוטנציאלי לטיפול. אתגר מרכזי בדגימות קליניות הוא החומר המוגבל והארטיפקטים הנגרמות מקיבוע. עם זאת, עם זרימת העבודה האופטימלית שלנו ומיקרוסופת רגישות di, אנו יכולים לכמת עד 50 PTMs היסטונים מתוך 1000 תאים בלבד.

אנו מראים שספקטרומטריית מסה יכולה לכמת שינויים ב-PTM בהיסטונים בדגימה קלינית, להציע תובנות לגבי מנגנון אפיגנטי ולאפשר גילוי סמנים ביולוגיים וזיהוי מטרות תרופות לטיפולים אפיגנטיים מדויקים. הפרוטוקול שלנו מתמודד עם הצורך בפרופילינג חזק, כמותי ורגיש על PTM היסטוני בדגימות קליניות שונות. ספקטרומטריית מסה אידיאלית לניתוח PTM היסטוני, ומציעה גילוי בלתי מוטה, פרופילינג סימולטני והופעה משותפת על אותו פפטיד, ובכך מתגברת על מגבלות שיטות מבוססות נוגדנים.

כדי להתחיל, הפשיר את הרקמה הקפואה הטרייה על קרח ובאמצעות סכין או להב, חתכו חתיכה של כ-20 עד 30 מיליגרם המהוות לכ-2 מילימטרים מעוקבים של רקמה. העבר את דגימת הרקמה שנחתכה לצינור של 1.5 מיליליטר. בעזרת מספריים, טחנו את הרקמה לחתיכות קטנות.

הוסיפו מיליליטר אחד של בופר בידוד גרעינים טרי בתוספת מעכבי פרוטאז שנקבעו וקצצו את הרקמה שוב. העבר את הדגימה להומוגניזר למטה. שימוש בעלי הרופף תחילה, ואז בעלי הדוק, הומוגני את הרקמה עד שלא יישארו חלקים נראים לעין.

סנן את הדגימה ההומוגנית דרך מסננת תאים בגודל 100 מיקרומטר כדי להסיר שאריות רקמה. פיפט את הדגימה המסוננת למעלה ולמטה בעוצמה באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להמיס את ממברנת הפלזמה. העבר את הדגימה לצינור חדש בנפח 1.5 מיליליטר.

הכניסו את הצינור לצנטריפוגה על שולחן וסובבו ב-2,300 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לשחרר את הגרעינים. לאחר השלכת הסופרנאנט, החזירו את הכדור הגרעיני ל-50 עד 100 מיקרוליטר של בופר בידוד גרעינים, עם תוספת של 0.1% SDS להפשרת הממברנה הגרעינית. לאחר מכן מוסיפים 250 יחידות של בנזונאז נוקלאז לדגימה המושפעת כדי לעכל חומצות גרעין.

ערבבו היטב ודוגרו במשך שתי דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לדגימות קפואות בטמפרטורת חיתוך אופטימליות, שטפו את הרקמות במי אתנול ו-PBS לפני טחינה והפקת היסטונים. הוסיפו מיליליטר אחד של חומר ממיס פרפין לדגימת ה-FFPE, שנלקחה בצינור של 1.5 מיליליטר ובמערבולת במהירות מקסימלית למשך 30 שניות עד שהפרפין נמס לחלוטין.

צנטריפוגה את הדגימה בעוצמה של 16,000 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר וזרקו בזהירות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה עם קצה קטן, תוך הימנעות מהכדור. עכשיו הוסיפו מיליליטר אחד של 95% אתנול לכדור ולמערבולת במהירות מקסימלית למשך 30 שניות. צנטריפוגה את הדגימה בטמפרטורה של 16,000 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את הסופרנטנט.

לאחר ההידרציה מחדש של הדגימה, הוסף 200 מיקרוליטר של בופר חילוץ לכדור. הומוגניזציה של הרקמה בבופר החילוץ על ידי זנות עם סימן דיגיטלי באמצעות קצה מיקרו בקוטר שלושה מילימטר. לאחר ההומוגניזציה, דגרו את הדגימה במיקסר תרמו ופתחו לזמן קצר את מכסה הצינור כדי לאפשר לפורמלדהיד להתאדות.

לאחר צנטריפוגה, העבר את הסופרנטנט לצינור מסומן חדש. להסיר את רצועות הג'ל המתאימות למשקל המולקולרי של חלבוני היסטון הליבה הממוקמים בין 10 ל-18 קילו-דלטון באמצעות סכין מנתח. לאחר החיתוך של רצועות הג'ל, השתמשו באותו סכין כדי להעביר את חתיכות הג'ל החתוכות לצינור של 1.5 מיליליטר.

כדי להסיר את הצביעה של הג'ל, מוסיפים תמיסה של 50% אצטוניטריל במים מזוקקים כפול ודגרו את הצינור במיקסר תרמו במהירות של 1,400 סיבובים לדקה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. ייבוש חתיכות הג'ל על ידי הוספת 100% אצטוניטריל. מערבבים את המיקסר התרמי במהירות של 1,400 סיבובים לדקה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר השלכת הסופרנטנט, ייבשו את חלקי הג'ל במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בצנטריפוגה ואקום. לאחר מכן, הוסף 15 מיקרוליטר של תמיסת פרופוניקנהידריד 7.7 מולרית, ו-26 מיקרוליטר של ביקרבונט אמוניום מולרי אחד לכל צינור ולדגר. לאחר מכן דגרו את הדגימה ב-80 מיקרוליטר של ביקרבונט אמוניום מולר אחד.

לאחר מכן שטפו את חתיכות הג'ל שלוש פעמים במים מזוקקים כפול והשליכו את הנוזל אחרי כל דגירה. לאחר מכן, הוסיפו 50% אצטון ניטריל לחתיכות הג'ל ודוגרו בקצב של 1,400 סיבובים לדקה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. ואז מוסיפים 100% אצטוניטריל כדי לייבש לחלוטין את חתיכות הג'ל.

דגרו במיקסר התרמי במהירות של 1,400 סיבובים לדקה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הנוזל, ייבשו את חתיכות הג'ל במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בצנטריפוגה בוואקום. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת טריפסין ו-20 מיקרוליטר של בופר עיכול לכל צינור המכיל חתיכות ג'ל.

דגרו את הצינורות על קרח במשך 10 דקות כדי לאפשר ספיגת טריפסין לג'ל. לאחר שהטריפסין נספג במלואו, הוסיפו 80 מיקרוליטר של בופר עיכול כדי לכסות לחלוטין את חתיכות הג'ל ודוגרו את הצינורות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במיקסר תרמו. כדי להפיק את הפפטידים המעכלים, הוסף 100 מיקרוליטר של 100% אצטו ניטריל לכל שפופרת, ודגר בקצב של 1,400 סיבובים לדקה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר במיקסר תרמו.

עכשיו, אסוף בזהירות את הסופרנטנט והעבר אותו לצינור חדש בנפח 1.5 מיליליטר. לאחר חזרה על הפקת האצטו ניטרו עם הג'ל שנותר, יש לאסוף את הסופרנטנטים. ריכזו את הפפטידים המאוגדים בצנטריפוגה בוואקום עד שנפח בין אחד לחמישה מיקרוליטר.

לאחר מכן מוסיפים שני מיקרוליטרים של טריאתילמוניום ביקרבונט מולר אחד, ושלושה מיקרוליטרים של תמיסת פניל איזוציאנאט. דגרו את הדגימה במהירות של 350 סיבובים לדקה במשך 90 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במיקסר תרמו. כדי לעצור את הגזירה, הוסף שמונה מיקרוליטרים של חומצה טריכלורואצטית 1% לכל צינור.

לבסוף, דילל כל דגימה על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של בופר A וטעין את הדגימות המדוללות על קצות שלב C18 לצורך הסרה. הפקת היסטונים הושגה בהצלחה מדגימות מוקפאות טריות, OCT מוקפאות ודגימות FFPE באמצעות תהליכי עיבוד דיפרנציאליים הספציפיים לכל סוג רקמה. למרות העשרה נמוכה יותר ונוכחות חלבון רקע, היסטונים H3, H2A, H2B ו-H4 הופקו בהצלחה מדגימות FFPE, כפי שמודגם ברצועות ב-FFPE1 ו-FFPE2 של הנתיב, המיושרים לכ-מיקרוגרם אחד של תקן H3.1.

כרומטוגרפיה ננו-נוזלית וניתוח טרשת נפוצה של היסטונים שמקורם ב-FFPE הראו הפרדה מוצלחת של פפטידי היסטון לאורך גרדיאנט של 55 דקות, עם שיאי זמן שמירה ברורים שנרשמו בכרומטוגרמה היונית הכוללת. כרומטוגרמות יונים שהופקו אישרו את זיהוי וכימות הצורות הלא מותאמות והמתילציה של H3 K 4 עם פרופילי שחרור נפרדים לכל ערך M על Z. מאפשר חישוב אחוז השפע היחסי לכל שינוי.

ניתוח השוואתי של שינויים בהיסטונים בין דגימות תקינות לגידול הראה עליות משמעותיות בסוגים מסוימים וירידה בסוגים אחרים ברקמות הגידול.