טכניקת הזרקה תת-רשתית טרנססקלרלית זעיר פולשנית אופטימלית בעכבר

זריקות תת-רשתית הן כלי חשוב לחקירות פרה-קליניות של טיפולים במחלות רשתית תורשתיות. בסרטון זה, אנו מציגים טכניקת הזרקה תת-רשתית אופטימלית, זעיר פולשנית בעכברים. הזרקות תת-רשתית טרנססקלרליות הן דרך מצוינת להעביר חומר לקולטני אור ו-RPE.

עם זאת, טכניקה זו מאתגרת מבחינה טכנית וקוראת לפיתוח פרוטוקול אופטימלי כדי להגביר את יכולת השחזור והנגישות שלו. השיפורים שלנו כוללים פיתוח ספקולום עפעפיים של עכבר, מתן טרום ניתוחי של אטרופין, יצירת סקלרוטומיה מדויקת באמצעות סכין יהלום ואופטימיזציה של גודל המחט וגישת ההזרקה. אנו מקווים שהעקביות של השיטה שלנו, יכולת השחזור, כיסוי ההעברה המצוין והנזק הניתוחי המינימלי ישפרו את הנגישות של זריקות תת-רשתית לקהילה המדעית.

האופטימיזציות שלנו מקלות ומהירות על ביצוע הזרקות תת-רשתית בעכברים, מפחיתות את השונות הניסויית ומשפרות את שיעורי הצלחת ההזרקה. טכניקה זו תקל על מחקר רשתית תרגומי פרה-קליני עתידי. כדי להתחיל, יש לתת מיליגרם אחד לק"ג אטרופין תוך-צפקי בנפח כולל של 50 מיקרוליטר 30 דקות לפני ביצוע ההזרקה התת-רשתית.

טען מיקרו-מחט זכוכית בנפח הרצוי של תמיסת ההזרקה. חבר את המחט למזרק המיקרו והגדר את לחץ הפיצוי לחמישה הקטופסקלים כדי לנטרל את פעולת הנימים. הנח את העכבר המורדם מתחת לסטריאומיקרוסקופ מנתח.

מרחו טיפה של 0.5% פרופרקאין על העין כדי להשיג הרדמה מקומית. יש למרוח טיפה של תערובת המכילה 0.2% ציקלופנטולאט ו-1% פנילפרין על העין כדי להרחיב את האישון לצורך הדמיה לאחר הניתוח של הגוש התת-רשתית ולהפחתת דימום תוך ניתוחי. באמצעות ספקולום חוט מיניאטורי מותאם אישית, חשוף את הפורניקס העליון ושיתק את הספקולום כדי לאפשר נסיגת עפעפיים עליונים ללא ידיים.

בעזרת מספריים זוויתיים של ואנאס, בצע זוג חתכים לימביים כמילימטר אחד מאחורי הלימבוס בלחמית העליונה ובקפסולה של טנון כדי לחשוף את הסקלרה העליונה. הסר בזהירות את שאריות הקפסולה של טנון מעל מקום ההזרקה. כעת אחוז בקצה הקדמי של ציק הלחמית והטנטוטומיה בעזרת מלקחיים עם שיניים נעולות.

לאחר מכן הורד בעדינות את הגלובוס כדי לחשוף את הסקלרה העליונה. מרחו מיד טיפה של מי מלח מאוזן על העין כדי לשמור על לחות הסקלרה החשופה ולהשיג הגדלה אופטית גדולה יותר. בעזרת סכין יהלום, בצע סקלרוטומיה מדויקת בערך בשעה 12 ומילימטר עד שני מילימטרים מהלימבוס.

מיקום הלהב באופן משיק לסקלרה כדי להבטיח שהסקלרוטומיה קטנה ורדודה. השתמש בספוג כירורגי כדי להסיר בעדינות את כל מי המלח המאוזנים מפני השטח של העין. החזק את שיפוע המחט כלפי מטה בזווית רדודה לסקלרה והכנס לאט את הקצה לתוך הטרשת, והתקדם רק 0.5 עד מילימטר אחד כדי לגשת לחלל התת-רשתית מבלי לחדור לרשתית.

תוך כדי החזקת המחט יציבה, התחל הזרקה ב-500 הקטופסקאלה באמצעות דוושת כף הרגל ושמור על לחץ רציף למשך 15 שניות. הסר את המחט וצפה בריפלוקס חלקי של התמיסה המוזרקת דרך אתר הטרשת, מה שמעיד על לידה מוצלחת מכיוון שהחלל התת-רשתית אינו יכול להכיל את מלוא הנפח של התמיסה המוזרקת. הסר בזהירות את מלקחיים הנעילה ואת ספקולום העפעפיים מבלי להפעיל לחץ על הגלובוס כדי למנוע ריפלוקס נוסף.

מיד לאחר ההזרקה, יש למרוח כמות נדיבה של משחת עיניים סיכה על העין כדי לסייע בהדמיית הבלב התת-רשתית. בלם תת-רשתית נראה בבירור ב-OCT מיד לאחר ההזרקה הטרנססקלרלית, מה שאישר לידה מוצלחת. כדי להעריך את אפיתל פיגמנט הרשתית, או RPE, הוזרק דיסטרופין AAV-8 1-GFP, וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות ירוקה נרחבת על פני שכבת האפיתל, מה שמעיד על התמרת RPE יעילה ורחבה באמצעות הגישה הטרנססקלרלית.

AAV-8 רודופסין GFP הוביל לאות פלואורסצנטי ירוק חזק בקולטני האור של המוט, הנראה הן בחתכים והן בתצוגות פונדוס, מה שמצביע על מיקוד וביטוי מוצלחים בתאי קולטני האור. AAV8-CAG-mCherry ייצר פלואורסצנטיות אדומה רחבה על פני שכבות הרשתית, מה שמדגים את יכולתה של טכניקה זו לתמוך בביטוי טרנסגנים כללי מעבר לסוגי תאים ספציפיים. כתמים מערביים של ליזאטים ברשתית הראו גם ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק חזק עם הרמות הגבוהות ביותר המתאימות למרכז ההזרקה, מה שאישר התמרת קולטני אור עם AAV8 רודופסין GFP.

אופטימיזציה של טיטר AAV באמצעות ניתוח אימונופלואורסצנטי של קטעי רשתית מאפשרת בחירת טיטר ויראלי המשיג התמרה של כ-90% מתאי המטרה. לדוגמה, במקרה זה, דילול של 1 עד 10 של מלאי ויראלי AAV8 רודופסין GFP ייצר ביטוי טרנסגנים כמעט בכל קולטני האור. לעומת זאת, דילול של 1 עד 100 הביא לקצב התמרה לא מספיק.

אלקטרורטינוגרמה הראתה כי זריקות טרנססקלרליות שמרו על תפקוד תקין של הרשתית בעוד שהזרקות טרנס-רשתית הובילו להפחתה משמעותית בתגובות גל A וגל B, מה שמעיד על נזק לרשתית.