מיקרוסקופיה רב-הרמונית אוטופלואורסצנטית בו-זמנית ללא תוויות
August 29th, 2025
פרוטוקול זה מציג מדריך שלב אחר שלב לטכניקה המיקרוסקופית של אוטופלואורסצנציה רב-הרמונית (SLAM) סימולטנית, כולל פרטים כיצד ליצור את מקור אור הלייזר, להכין דגימת רקמה, לבצע הדמיה ולנתח את הנתונים. SLAM מקדם מיקרוסקופיה לא ליניארית על ידי מדידת ארבעה ניגודים משלימים ללא תוויות כדי לחקור את המיקרו-סביבה של הרקמה.
מיקרוסקופיה רב-הרמונית אוטופלואורסצנטית סימולטנית ללא תוויות, או מיקרוסקופ SLAM, לוכדת מידע ייחודי בדגימות ביולוגיות על ידי מדידת אינטראקציות לא ליניאריות עם אור. במעבדה שלנו אנו משתמשים בשיטה הזו כדי לחקור חיים ומחלות בקנה מידה מיקרוסקופי. אנו צופים במעבר להדמיה מולטי-מודאלית ללא תוויות, המציעה תובנות עשירות יותר לגבי מבנים ודינמיקה של תאים ורקמות, תוך הימנעות מרעילות ומתן אפשרות לניגודים ומתאמים משלימים בין האופנים.
מיקרוסקופים לא ליניאריים חדישים ללא תוויות רוכשים אות אחד בכל פעם, ומסתכנים בחוסר יישור, נזק לצילום והרבה תהליכים במקביל. ה-SLAM מתגבר על בעיות אלה על ידי מתן ניגודיות רב-מודאלית רשומה בקפדנות, ומבטיח נתונים מרחביים וזמניים אמינים. טכניקה זו מאפשרת עירור וזיהוי בו זמנית של ארבעה ערוצים במיקרוסקופ רב-פוטוני.
שימוש בסיבי גביש פוטוניים להרחבת פולסים עבור SHG, THG ופלואורסצנציה של שניים ושלושה פוטונים. SLAM לוכד מידע מטבולי מבני ודינמי של איתות תאים ללא חפצי יישור או תוויות אקסוגניות, מה שמאפשר ניתוח רקמות כמותי סטנדרטי. היישומים שלו משתרעים על ביולוגיה בסיסית, מחקר תרגומי וגילוי סמנים ביולוגיים באונקולוגיה, ניוון עצבי והתחדשות רקמות.
כדי להתחיל, השתמש בספקטרומטר או במנתח ספקטרום אופטי כדי למדוד את הלייזר לאחר המראה הפרבולית ולאמת את יצירת הרצף הסופר-רציף של סיב הגביש הפוטוני. סובב את לוח האמצע לאחר מפצל האלומה המקטב כדי למטב את רוחב הסופר-רצף. הפעל את המתאם האוטומטי של המיקרוסקופיה.
בתוכנה, הגדר את הגלאי לגלאי הפנימי והתאם את טווח הסריקה ל-5 פיקו-שניות כדי ללכוד את הרוחב המלא של המתאם האוטומטי של הדופק. בטל את חסימת הלייזר ויישר את המתאם האוטומטי לקרן היוצאת ממעצב הדופק עד להופעת אות. ודא שתריס 2 סגור.
לאחר מכן החל את אמצעי הטבילה המתאים, כגון מים או שמן, על עדשת האובייקטיב. הנח את הגלאי החיצוני של המתאם האוטומטי על המיקרוסקופ stage ומקם אותו ישירות מעל המטרה. כעת הפעל את מראות הגלוונומטר הסורקות כדי להגדיר את המתח שלהן ל-0.
פתח את התריס והשתמש במטרה פלואורסצנטית כדי לאשר שהקרן מגיעה לגלאי החיצוני. הגדר את גלאי המתאם האוטומטי כגלאי החיצוני. לאחר מכן כוונן את מיקום ה-stage עד להופעת האות.
התאם את המקדמים הפולינומיים של מעצב הדופק כדי למזער באופן איטרטיבי את רוחב הדופק הנמדד על ידי המתאם האוטומטי. ככל שרוחב הדופק יורד, צמצם את טווח הסריקה בהתאם כדי לשפר את הדיוק וההדמיה של פונקציית המתאם האוטומטי. ודא שכניסת הלייזר לסיב הגביש הפוטוני חסומה והפעל את הלייזר.
הניחו ללייזר להתחמם למשך 30 דקות. ודא שנתיב האלומה נקי ממכשולים, ולאחר מכן הנח מד כוח אופטי בנתיב האלומה ממש לפני סיב הגביש הפוטוני. לחץ על לחצן הבקרה כדי לפתוח את תריס 1 ולמדוד את עוצמת הכניסה.
סגור שוב את תריס 1. העבר את מד הכוח לפלט של סיב הגביש הפוטוני לאחר המראה הפרבולית. פתח את תריס 1 והשתמש בקלט שלושת הצירים tagכדי למקסם את עוצמת המוצא.
תן לסיב הגביש הפוטוני להתחמם למשך 10 דקות ואז למקסם את הספק המוצא שוב באמצעות שלב שלושת הצירים והקלט את השידור של ה-PCF. הזז את מד הכוח לאחר מסנן הצפיפות הנייטרלית וסובב את המסנן כדי לכוונן את עוצמת הלייזר המגיעה לדגימה. הכפל את ההספק הנמדד בהעברת האופטיקה הנותרת כדי לקבוע את עוצמת הדגימה.
כעת, הפעל את הגלוונומטרים והבמה. הפעל את תוכנת הרכישה והזן את פרמטרי ההדמיה הרצויים. הנח את הדגימה על הבמה באמצעות אותה מדיית טבילה שהוחלה קודם לכן על עדשת האובייקטיב.
לאחר מכן כבו את אורות החדר וסגרו את הווילונות כדי למנוע כניסת אור סביבתי. לאחר מכן, הפעל את ספקי הכוח והמגברים. סגור את תיבת האור המקיפה את שלב המיקרוסקופ.
השתמש במתגי הבקרה האלקטרוניים כדי לפתוח ידנית את תריסי הגלאי 3-6. בתוכנת הרכישה, לחץ על האפשרות לחץ כדי להתחיל ברכישה כדי להתחיל בהדמיית SLAM. כוונן את מיקוד המיקרוסקופ באמצעות stagכפתור בקר עד שהדגימה נראית בבירור.
השתמש בג'ויסטיק במיקרוסקופ tagבקר כדי למצוא את שדה הראייה הרצוי. לאחר המיקום, לחץ על עצור ואפס. תחת הכרטיסיה שמירה, העבר את שמירת הנתונים למצב כן.
לאחר מכן לחץ על האפשרות לחץ כדי להתחיל רכישה והמתן להשלמת ההדמיה. כדי לתפעל את הדגימה במהלך ההדמיה, סגור את תריסי הגלאי והשתמש בפנס או פנס ראש להארה. לאחר ההתאמות, חזור להגדרת ההדמיה.
כדי לסיים את רכישת התמונה, סגור את תריסי הגלאי, כבה את הגלאים ורק אז הפעל את אורות החדר. חסום את הלייזר באמצעות תריס 1, ולאחר מכן כבה את הלייזר. כבה את הגלוונומטרים ואת ה-stage וסגור את תוכנת הרכישה.
השלך את דגימת הרקמה כראוי ונקה את תחנת העבודה. סיב קריסטל פוטוני שסוע כהלכה הראה פנים שטוחות בניצב לציר שלו ופנים נקיות. סיבי גביש פוטוניים שסועים בצורה גרועה הראו חתכים בזווית, פנים סדוקות ושריטות או פסולת בולטות על פני השטח.
טיפול לא נכון או זיהום גרמו להצטברות לכלוך וחלקיקים גלויים סביב משטח הסיבים שהסתירו את דפוס חור האוויר. ליבה שרופה עם אזורים כהים הצביעה על סיב גביש פוטוני פגום בסוף חייו. ספקטרום הסופר-רצף השתרע על פני כ-975-1, 175 ננומטר עם חלק עליון שטוח ומודולציות ספקטרליות מובהקות.
מתאם אוטומטי של דופק לאחר דחיסה הראה פרופיל סימטרי עם חצי מקסימום צר ברוחב מלא, מה שמעיד על עיצוב דופק טוב. מקורות סופר-רצף מתפקדים כראוי הפיקו אותות הרמוניים חזקים שני ושלישי. סופר-רצף מצומצם הביא לאובדן עוצמת האות ההרמוני השלישי תוך שמירה על האות ההרמוני השני.
היעדר עיצוב פולסים הפחית באופן דרסטי את כל האותות הלא ליניאריים, והניב תמונה חלשה וניגודיות נמוכה. הדמיית SLAM מוצלחת של רקמת כליה ex vivo הראתה מבני נפרון מובהקים עם אותות אופטיים חזקים מרובים, כולל דור הרמוני שלישי ופלואורסצנטיות NADPH. סיבי קולגן אינטרסטיציאליים בכליות היו ניתנים לזיהוי באמצעות אותות חזקים של דור הרמוני שני.
תמונת יחס החמצון החיזור הצביעה על חילוף חומרים מיטוכונדריאלי אירובי מוגבר בצינורות הפרוקסימליים של קליפת הכליה בהשוואה למדולה. מפת יחס חמצון חיזור שנייה אישרה שונות מרחבית במטבוליזם חמצוני וגליקוליטי, וחיזקה את השימוש הדיפרנציאלי באנרגיה בתוך הרקמה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג מדריך מפורט לטכניקת מיקרוסקופיה רב-הרמונית אוטומטית ללא תוויות סימולטנית (SLAM), אשר מתעד מידע ייחודי בדגימות ביולוגיות. SLAM מקדם מיקרוסקופיה לא לינארית על ידי מדידת ארבעה ניגודים משלימים ללא תוויות לחקירת מיקרו-סביבת הרקמה.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביופיזיקה
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- מיקרוסקופיה SLAM מודדת אינטראקציות לא לינאריות עם אור.
- טכניקה זו מאפשרת עירור זורם וזיהוי סימולטני של ארבעה ערוצים.
- היא מספקת תובנות עשירות יותר לגבי מבנים תאיים ורקמותיים.
- SLAM נמנע מרעילות ומאפשר ניגודים משלימים בין מודלים.
מטרת המחקר
- לחקור את החיים והמחלות בקנה מידה מיקרוסקופי.
- להתגבר על בעיות של חוסר יישור ונזק פוטוגרפי בדימות מסורתי.
- לאפשר איסוף נתונים מרחביים ומרחביים אמינים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת דגימות רקמות לצורך הדמיה.
- ביצוע הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה SLAM.
- ניתוח נתונים המתקבלים מתהליך ההדמיה.
- ייצור מקור אור לייזר עבור המיקרוסקופיה.
תוצאות עיקריות
- SLAM מספק ניגוד רב-מודאלי משולב.
- הוא משפר את ההבנה של מיקרו-סביבות רקמות.
- הנתונים שנאספו אמינים ומקיפים.
- מיקרוסקופיה SLAM מאפשרת מחקר ביולוגי מתקדם.
מסקנות
- מיקרוסקופיה SLAM היא התקדמות משמעותית בטכניקות הדמיה.
- היא מאפשרת ניתוח מפורט של דגימות ביולוגיות ללא תוויות.
- טכניקה זו עתידה לשפר את המחקר בתחומים ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Simultaneous Label-Free Autofluorescence Multi-Harmonic (SLAM) microscopy enables multiplexed, quantitative imaging of tissue structure, metabolism, and cellular dynamics without exogenous labels. This capability addresses the need for standardized, artifact-free, and reproducible data in early discovery and translational research. SLAM's coregistered multimodal outputs support predictive confidence and mechanistic de-risking at critical pipeline inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of metabolic and structural features in native tissue environments.
- Supports functional target validation by correlating morphological and metabolic states.
- Reduces biological ambiguity by providing simultaneous, artifact-free multimodal readouts.
- Facilitates portfolio triage through robust, label-free phenotypic characterization.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible biological systems for downstream compound screening.
- Delivers quantitative, standardized outputs across multiple optical channels.
- Enables high-content, label-free assay development for multiplexed screening platforms.
- Improves screening reliability by eliminating alignment artifacts and photo-damage risks.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant metabolic and structural biomarkers.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling non-destructive tissue analysis.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in oncology, neurodegeneration, and tissue regeneration research.
- Enhances predictive de-risking by integrating functional and morphological data in situ.
Pipeline & Workflow Integration
SLAM microscopy integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing standardized, quantitative imaging for hypothesis testing, assay development, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through multiplexed, label-free imaging.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for high-content screening workflows.
- Analytics: Provides coregistered measurements of metabolic, structural, and functional tissue features.
- Translational Research: Enables non-destructive, disease-relevant biomarker analysis in human and animal tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized imaging platform for cross-program R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust, multiplexed data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nonlinear optics and advanced microscopy instrumentation.
- Demands access to ultrafast laser sources, photonic crystal fibers, and sensitive detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data processing pipelines.
- Adaptation across tissue types and disease models may require protocol optimization.
- Instrument maintenance and photonic crystal fiber handling are critical for consistent performance.
