Name: דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 Knock-in Zebrafish (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: למד שיטה משופרת ליצירת מוטציות אימהיות בזברה דגים באמצעות שורת zpc:cas9 knock-in ומערכת Tol2. פרוטוקול זה מאפשר חקר גורמים אימהיים הקשורים למוטציות זיגוטיות המובילות למוות עוברי או עקרות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Fuentes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal+coordinate+system%3A+Molecular-genetics+of+embryonic+axis+formation+and+patterning+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish.</a> Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Huluwa+dictates+the+embryonic+body+axis+through+%CE%B2-catenin+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates.</a> Science. 362 (6417), eaat1045(2018).</li>
<li>Abrams, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+maternally-controlled+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of maternally-controlled cell divisions.</a> PLoS Genet. 16 (4), e1008652(2020).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rbm24+controls+poly%28A%29+tail+length+and+translation+efficiency+of+crystallin+mRNAs+in+the+lens+via+cytoplasmic+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rbm24 controls poly(A) tail length and translation efficiency of crystallin mRNAs in the lens via cytoplasmic polyadenylation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (13), 7245-7254 (2020).</li>
<li>Weidinger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dead+end%2C+a+novel+vertebrate+germ+plasm+component%2C+is+required+for+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival.</a> Curr Biol. 13 (16), 1429-1434 (2003).</li>
<li>Ciruna, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germ-line+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14919-14924 (2002).</li>
<li>Xing, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+dishevelled+genes+in+zebrafish+reveals+distinct+functions+in+embryonic+patterning+and+gastrulation+cell+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements.</a> PLoS Genet. 14 (8), e1007551(2018).</li>
<li>Wu, X., Shen, W., Zhang, B., Meng, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+program+of+oocytes+can+be+modified+in+vivo+in+the+zebrafish+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary.</a> J Mol Cell Biol. 10 (6), 479-493 (2018).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+zebrafish+maternal+mutants+via+oocyte-specific+knockout+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of zebrafish maternal mutants via oocyte-specific knockout system.</a> Bio Protoc. 14 (21), e5092(2024).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+maternal+mutants+via+oocyte+transgenic+expression+of+CRISPR-Cas9+and+sgRNAs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish.</a> Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intron+targeting-mediated+and+endogenous+gene+integrity-maintaining+knockin+in+zebrafish+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Res. 25 (5), 634-637 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rbm24a+dictates+mRNA+recruitment+for+germ+granule+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish.</a> EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T5+exonuclease-dependent+assembly+offers+a+low-cost+method+for+efficient+cloning+and+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis.</a> Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).</li>
<li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+conditional+mutagenesis+using+transgenic+expression+of+Cas9+and+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs.</a> Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).</li>
<li>Shao, M., Cheng, X. N., Liu, Y. Y., Li, J. T., Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+zebrafish+cells+by+conventional+pneumatic+microinjector%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Transplantation of zebrafish cells by conventional pneumatic microinjector.</a> Zebrafish. 15 (1), 73-76 (2018).</li>
<li>Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+control+of+female+sex+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line control of female sex determination in zebrafish.</a> Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).</li>
<li>Aharon, D., Marlow, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Sexual determination in zebrafish.</a> Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).</li>
<li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+early+embryonic+primordial+germ+cells+promotes+zebrafish+female+differentiation+as+revealed+by+lifetime+labeling+of+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Abundance of early embryonic primordial germ cells promotes zebrafish female differentiation as revealed by lifetime labeling of germline.</a> Mar Biotechnol (NY). 21 (2), 217-228 (2019).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+formation+of+primordial+germ+cells+from+zebrafish+blastomeres+by+germplasm+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors.</a> Nat Commun. 14 (1), 7918(2023).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Bertho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dazl+regulates+cystogenesis+and+germline+stem+cell+specification+during+the+primordial+germ+cell+to+germline+stem+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition.</a> Development. 148 (7), dev.187773(2021).</li>
<li>Houwing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Piwi+and+piRNAs+in+germ+cell+maintenance+and+transposon+silencing+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish.</a> Cell. 129 (1), 69-82 (2007).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetally+localised+Vrtn+functions+as+a+novel+repressor+to+modulate+bmp2b+transcription+during+dorsoventral+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish.</a> Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2x M5 HiPer Taq PCR mix</td><td>מיי5ביו</td><td>חתול#MF001-BD-100</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>מ.ד.ביו</td><td>חתול#A006L</td><td></td></tr><tr><td>ערכת AxyPrep Plasmid Miniprep</td><td>אקסיג'ן</td><td>חתול#AP-MN-P-4</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר אלקטרופורזה נימית (Qsep400)</td><td>BiOptic</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>תערובת תיוג DIG</td><td>רוש</td><td>חתול#11277073910</td><td></td></tr><tr><td>דנאס א</td><td>רוש</td><td>חתול#4716728001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>חתול#R0861</td><td></td></tr><tr><td>ערכת סינתזת cDNA גדיל ראשון</td><td>טרנסג'ן ביוטק</td><td>חתול#AT301</td><td></td></tr><tr><td>GenCrispr NLS-Cas9-NLS נוקלאז</td><td>GenScript</td><td>חתול#Z03389</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית (1.0 x 100 מ"מ)</td><td>מפעל ציוד חינוכי רנטאי</td><td>חתול#OS-2B</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>BBI מדעי החיים</td><td>חתול#28985</td><td></td></tr><tr><td>פריזמה GraphPad 9</td><td>GraphPad</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td></tr><tr><td>תמונהJ</td><td>קוד פתוח</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז נמס נמוך</td><td>ביוטכנולוגיה</td><td>חתול#CA1351</td><td></td></tr><tr><td>Microforge (MF2)</td><td>נארישיגה</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-ספקטרופוטומטר (Nano-300)</td><td>אלשנג</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>אוליביה</td><td>אולימפוס</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>ג'יבקו</td><td>חתול#15140122</td><td></td></tr><tr><td>מזרק פיקו-ליטר (PLI-100A)&nbsp;</td><td>מנגנון הרווארד</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה מחודדת</td><td>WPI</td><td>חתול#500341</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה מחודדת</td><td>&nbsp; WPI&nbsp;</td><td>500341</td><td></td></tr><tr><td>חולץ (PC-100)</td><td>נארישיגה</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RiboLock RNase</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>חתול#EO0381</td><td></td></tr><tr><td>rNTP</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>חתול#R0481</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים מגנטיים סיליקון הידרוקסיל</td><td>סנגון ביוטק</td><td>חתול#B518720-0001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA פולימראז</td><td>נב</td><td>חתול#M0251L</td><td></td></tr><tr><td>זולד</td><td>WPI</td><td>תבניות Z של Cat#</td><td></td></tr></tbody></table>

דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 knock-in zebrafish

Generation of Maternal Mutants Using zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

יצירה מהירה של מוטציות אימהיות rbm24a בנינו וקטור טרנסגני המאפשר ביטוי של סמן BFP אימהי וארבעה sgRNAs יעילים ביותר המכוונים לרצף הקידוד rbm24a. בעקבות הכנסת וקטור זה לעוברים הומוזיגוטיים rbm24a-RFP KIzpc:cas9 באמצעות טרנספוזיציה של Tol2, Mrbm24a זוהה בקלות ובמהירות בקרב עוברי F1 חיוביים ל-BFP עקב היעדר חלבון Rbm24a-RFP (איורe 11A-D). כ-...

דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

Oogenesis and early embryonic development are critically dependent on maternally derived mRNAs and proteins. Eliminating these maternal factors ...

generation-of-maternal-mutants-using-zpccas9-knock-in-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

מדריך צעד אחר צעד כדי ליצור ממוקד עוברי דג הזברה chimeric על ידי השתלת בשלב blastula או gastrula.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

סרטון זה מתאר טכניקה של מיקרו-הזרקה של עוברים כדי להעביר תרכובות לתוך שק החלמון של דג הזברה.

מיקרו-הזרקה עוברית: טכניקה להעברת תרכובת לחלמון דג הזברה

דג הזברה הוא מערכת מודל רבת עוצמה לביולוגיה התפתחותית וחקר מחלות אנושיות בשל הדמיון הגנטי שלהם עם בעלי חוליות גבוהים יותר. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה ליצירת עוברי דג זברה הפלואידים שניתן להשתמש בהם לאסטרטגיות מסך קדימה לזיהוי מוטציות רצסיביות בגנים החיוניים לאמבריוגנזה מוקדמת.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

פרוטוקול אופטימיזציה עבור הבשלה חוץ גופית של ביציות דג הזברה המשמש מניפולציה של מוצרים הגן האימהי מוצג כאן.

מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים הגן באמצעות<em&gt; במבחנה</em&gt; הבשלת ביצית דג הזברה

המטרה של פרוטוקול זה היא לשנות את penetrance של פנוטיפים קטלני השלד מוטציה בדג זברה באמצעות ברירה מלאכותית. מוטציות קטלני זין לבגרות וגדלתי עצמם, לכן פרוטוקול זה מתאר שיטת מעקב ובחירה penetrance לאורך הדורות מרובים על-ידי רומא בדיקות.

הסטה דג זברה קטלני השלד Penetrance מוטציה על ידי רומא בדיקות

הגנום יישוב עריכה במערכת מודל רזבורה rerio (דג זברה) כבר באופן משמעותי בהנחייתם של הופעתה של גישות CRISPR. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול יעילים, חזקים הדור, זיהוי של אללים נגזר CRISPR שטויות המשלבת וזמינותו ניידות heteroduplex וזיהוי מוטציות באמצעות הדור הבא רצפי.

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

פיתוח מוקדם תלוי במוצרים שעברו בירושה אימהית, ותפקידם של רבים ממוצרים אלה אינו ידוע כיום. כאן תיארנו פרוטוקול המשתמש ב-CRISPR-Cas9 כדי לזהות פנוטיפים בעלי השפעה אימהית בדור אחד.

קביעת תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם בהתפתחות מוקדמת עם קריספנטים אימהיים

פרוטוקול זה מתאר גישה המאפשרת עריכות מדויקות של דגי זברה באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. צינור פנוטיפ מוצג כדי להדגים את הישימות של טכניקות אלה כדי לדגום וריאנט גן הקשור לתסמונת QT ארוכה.

CRISPR-Cas9-עריכות מדויקות בתיווך בלבבות דגי זברה

עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

טכנולוגיות CRISPR-Cas חוללו מהפכה בתחום עריכת הגנום. עם זאת, מציאת ובידוד עריכת קו הנבט הרצויה נותרה צוואר בקבוק משמעותי. לכן, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון מהיר של זרע דג זברה מוזרק F0 CRISPR לעריכות קו הנבט באמצעות טכניקות PCR סטנדרטיות, תקציר הגבלה ואלקטרופורזה בג'ל.

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

למד שיטה משופרת ליצירת מוטציות אימהיות בזברה דגים באמצעות שורת zpc:cas9 knock-in ומערכת Tol2. פרוטוקול זה מאפשר חקר גורמים אימהיים הקשורים למוטציות זיגוטיות המובילות למוות עוברי או עקרות.

דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

גלה סרטונים נוספים