דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מוטציה אימהית המצמיד קו נוק-אין יציב של zpc:cas9 עם מסירה בתיווך Tol2 של קלטות ביטוי sgRNA.

בסרטון זה, אנו מציגים שיטת נוקאאוט משופרת למצב ספציפי לביצית בדגי זברה, המציעה פלטפורמה רב-תכליתית לחקר גורמים אימהיים עם מוטציות זיגוטיות הגורמות לקטלניות או עקרות. שיטת הנוקאאוט האימהית הנוכחית מאתגרת מבחינה טכנית או גוזלת זמן. דיווחנו בעבר על טרנסגן zpc:cas9 מושתק באופן שעתוק לאורך דורות.

באמצעות קו הדפיקה zpc:cas9, הקמנו פלטפורמה חזקה ליצירת נוקאאוט מותנה במהלך אוגנזה, המאפשרת ייצור מהיר ויעיל ביותר של מוטציות אימהיות. כדי להתחיל, אסוף עוברים שהושרצו על ידי דגי rbm24a RFPKI zpc:cas9 הומוזיגוטיים. שלב מיקרוליטר אחד של אבק PGG EB rbm24a 4sGRNA עם מיקרוליטר אחד של RNA שליח טרנספוזאז Tol2 להכנת תערובת ההזרקה.

יש לדלל גם את הפלסמיד וגם את ה-RNA השליח Tol2 ישירות במים טהורים. כעת הניחו כיסוי זכוכית בכלי בגודל 90 מילימטר. יישר את העוברים לאורך קצה הכיסוי, והשתמש בעדינות בפיפטה כדי להסיר עודפי מים.

לאחר מכן הזרקו שני ננוליטרים מהתערובת המוכנה לתוך הבלסטודיסק של כל עובר בשלב תא אחד. שוטפים בעדינות את העוברים המוזרקים במים כחולים, ומעבירים אותם לכלי אחר. מניחים את המנה בחממה המכוונת ל -28 מעלות צלזיוס לגידול.

24 שעות לאחר ההפריה, בחר עוברים המראים ביטוי חלבון פלואורסצנטי כחול חזק ונמצא בכל מקום. ארבעה ימים לאחר ההפריה, יש לגדל רק את העוברים השומרים על אותות פלואורסצנטיים טרנסגניים חזקים. אסוף עוברים שנוצרו מפסיפס הזדווגות של נקבות מייסדות טרנסגניות עם זכרים מסוג בר.

בעזרת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי, הרם את העוברים הכחולים החיוביים לחלבון פלואורסצנטי בשלב התא האחד. לאחר מכן יש לתקן את העוברים בשלבים המתאימים ב-4% פרפורמלדהיד בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. להכנת תמיסת OGER של 1.5%, שקלו ושלבו אבקת OGER במאגר רינגר בעוצמה של 1/3 והרתיחו עד להמסה מלאה.

יוצקים את תמיסת ה- OGER המומסת לצלחת פטרי בגודל 90 מילימטר ומכניסים תבנית Z לאגרוז המותך. לאחר שהאגרוז התמצק, הסר בעדינות את התבנית ליצירת צלחת מוכנה לשימוש. לאחר מכן, התאם את ההגדרות בחולץ המחט כדי להשתמש בשתי משקולות קלות, ובחר את הליך השלב הראשון.

טען את נימי הזכוכית לתוך המושך כדי ליצור מחטים אטומות להמיס. בעזרת פינצטה מחודדת, חתוך את קצות הנימים לקוטר של 30 עד 40 מיקרומטר. לאחר מכן השתמש במיקרו-זיוף כדי ליצור ספייק בקצה, שיסייע בחדירת העובר ויפחית את הנזק לרקמות.

הזדווגו את המייסדות המשוערות עם דגי זברה מסוג בר ואספו עוברים. בשלב התא האחד, בודד עוברים חיוביים לחלבון פלואורסצנטי כחול באמצעות סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי. שלוש שעות לאחר ההפריה, דגרו את העוברים בפרונאז, מומסים בשליש חוזק של חוצץ רינגר למשך 10 דקות עם פיפטינג עדין כדי לפרק אותם.

העבירו בזהירות את העוברים המפורקים לצלחת הארגרוז המוכנה המוצפת ב-1/3 מאגר רינגר, בתוספת סטרפטומיצין פניצילין. כוון מחדש את העוברים כך שהבלסטומר פונה לכיוון קצה הנימים לשאיבת תאים. כעת השתמש במיקרו-מזרק כדי לשאוב 20 עד 40 תאים מכל עובר על ידי הפחתת לחץ שיווי המשקל בעדינות כדי להתמודד עם כוח השאיפה הנימים.

הגדל את לחץ שיווי המשקל כדי לשחרר את התאים הנשאבים לשני מיקרוליטרים של מים נטולי יונים בקצה צינורות אפנדורף של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטר של מגיב מיצוי RNA לצינור כדי לשטוף את התאים הנשאבים, והנח את הצינור על קרח לאחסון זמני. שמור את העוברים לאחר שאיבת התאים על צלחת האגרוז עד לדמיון פנוטיפים חריגים.

לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטר כלורופורם לתאים מעוברים נבחרים במגיב המיצוי וערבב בעדינות. לאחר מכן צנטריפוגה את התערובת בחום של 12, 000 גרם למשך דקה בטמפרטורת החדר. לאחר איסוף הסופרנטנט, הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסת גליקוגן.

לאחר מכן מוסיפים נפח שווה של איזופרופנול על בסיס נפח הסופרנטנט ומערבבים היטב. דגרו את הצינור במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר משקעי RNA. כעת צנטריפוגה את הדגימה ב-12,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.

לאחר מכן כדי לשטוף את כדור ה- RNA פעמיים, הוסף 500 מיקרוליטר של אתנול 70% וצנטריפוגה ב -12, 000 גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט, פתחו את מכסה הצינור כדי לאפשר לגלולה להתייבש בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הוסף שבעה מיקרוליטר מים כדי להמיס את כדור ה-RNA.

בצע שעתוק הפוך באמצעות ערכת סינתזה של First Strand cDNA, ולאחר מכן בצע ריצוף PCR ו-Sanger כדי לנתח מוטציות בעוברים מוטנטיים אימהיים. מוטציות אימהיות rbm24a זוהו על ידי היעדר rbm24a RFP, בעוד שמוטציות אימהיות אחרות זוהו על ידי פנוטיפים ספציפיים או גנוטיפ מבוסס שאיבת תאים. בקרב עוברים חיוביים ל-BFP, אלה חסרי אות RFP זוהו כמוטציות אימהיות rbm24a.

הכלאה באתרה באמצעות בדיקת NANOS3 גילתה כי עוברי Mrbm24a לא הצליחו לגייס mRNA של פלזמת נבט לגרגירי נבט בשלב ארבעת התאים, וחסרו תאי נבט קדמוניים 24 שעות לאחר ההפריה. כל הזכרים הבוגרים Mrbm24a לא הצליחו להפרות ביצים שהושרצו על ידי נקבות מסוג בר, והראו חריגות אנטומיות עם משקעי שומן שהחליפו אשכים רגילים. ניתוח היסטולוגי אישר את היעדרם המוחלט של תאי נבט וזרעונים באשכי Mrbm24a.

ניתוח כתמים מערביים אישר רמות כמעט בלתי ניתנות לזיהוי של חלבון rbm24a בעוברים שליליים ל-RFP חיוביים ל-BFP. תוצאות RT-qPCR הראו רמות תעתיק נמוכות משמעותית של rbm24a בעוברים חיוביים ל-RFP שליליים בהשוואה לביקורת. ריצוף RT-PCR ו-Sanger חשף מחיקות גדולות ואינדלים הן בעוברים חיוביים ל-BFP שליליים ל-RFP והן בעוברים חיוביים ל-RFP עם תעתיקים מסוג פרא הניתנים לזיהוי רק בעוברים חיוביים ל-RFP.

סמן GFP אימהי ו-nanog sgRNAs הוצגו כדי ליצור מוטציות ננו-גרם אימהיות, ועוברים חיוביים ל-GFP הראו מגוון של פנוטיפים גביים. שיעורי העברת קו הנבט נעו בין 12% ל-32% בקרב קווים טרנסגניים חיוביים ל-GFP. פנוטיפ גבי התואם למוטציות ננוג אימהיות נצפה ב-22% עד 60% מהעוברים החיוביים ל-GFP.