חקר אינטראקציות חלבון-גליקן: התקדמות בתהודה מגנטית גרעינית
26 באוגוסט 2025
פרוטוקול מבוסס NMR זה חוקר אינטראקציות חלבון-גליקן חלשות באמצעות ציאנובירין-N ו-D-מאנוז. בשילוב שיטות זיהוי ליגנד וחלבון, הוא ממפה אתרי קשירה, מזהה השפעות אלוסטריות ומזהה קומפלקסים של מפגשים. הגישה מתארת הכנת דגימה וניתוח נתונים, ומציעה תובנות מבניות ודינמיות בעלות ערך עבור מנגנוני אבחון וזיהוי ספציפיים לגליקן.
אנו חוקרים אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-גליקן, תוך התמקדות בקומפלקס אינטגרין-דיסינטגרין. המודל שלנו בוחן דינמיקה מבנית ומדגיש את תפקידו של כוח פני השטח בתיווך היווצרות מורכבת ויציבות אינטראקציה. הקבוצה שלנו מוקדשת לחקר תפקידם של כוחות פני השטח בזיהוי מולקולרי ואבולוציה של אתרי קשירה על ידי חקר צבירים הידרופוביים על פני השטח הקיימים בחלבונים.
פתרון NMR מאפשר זיהוי אינטראקציות חלבון. אף על פי שאינטראקציות חלשות חיוניות לחיים, קיימת הטיה לכיוון קומפלקסים בעלי זיקה גבוהה, אף על פי שהם קיימים בתפקודים ביולוגיים חשובים רבים. הקבוצה שלנו מתמקדת בשימוש בגישות ביולוגיה מבנית אינטגרטיבית כדי לחקור קומפלקס חלבונים גדול.
אנו משתמשים בתמ"ג ככלי העיקרי לחקר דינמיקה והיבטים פונקציונליים. כדי להתחיל, הכינו תמיסה של ארבעה מילי-מולרים של D-מנוז במאגר נתרן פוספט ב-pH 7.4 עם 50 מילי-מולרי נתרן כלורי ו-5% תחמוצת דאוטריום. חלקו את התמיסה לשתי דגימות, האחת מכילה 80 מיקרו-מולרי CVN, והשנייה בלי.
למיפוי קשירת הליגנד באמצעות הפרעת הזזה כימית בספקטרומטר NMR, הגדר את רצף הדופק HSQCTOPSI לרכישת H1C13 HSQC. הגדר את תחום הזמן, הרוחב הספקטרלי, תדירות המוביל ומספר הסריקות. חשב הפרעה בהסטה כימית באמצעות המשוואה המצורפת.
כדי למפות קשירת ליגנד באמצעות הפרש העברת רוויה, ראשית, צור מערך נתונים חדש. הגדר את הפרמטרים עבור ניסויי STD NMR על ידי סינון תדרי רוויה שונים או קיבוע התדר תוך זמני רוויה משתנים כדי להעריך הצטברות. הגדר ניסויי תמ"ג 1D H1 באמצעות רצף הדופק של ZGPR.
כוונו את הספקטרומטר ל-H1, בצעו שימינג ומדדו דופק קשה של 90 מעלות. מרכז את תדר המוביל בערך ב-4.7 חלקים למיליון, המתאים לאות המים, ולאחר מכן בחר את ה-STDDIFFESGP. 3 רצף דופק והגדר את פרמטרי הרכישה.
הגדר את הרוחב הספקטרלי כנדרש, עיכוב בין סריקה D1 לארבע שניות, והגדר זמן רוויה D20, בהתאם למטרות הניסוי. טען את רשימת ה-FQ2 עם תדר תהודה מחוץ למינוס 40 חלקים למיליון ותדרי תהודה כדי להרוות חלבון בלבד. בדוק את תדרי התהודה של מינוס 0.59, 0.73 ו-8.1 חלקים למיליון כדי לקבוע תנאים אופטימליים.
השתמש בתדר האופטימלי כדי לרכוש ספקטרום STD בזמני רוויה של 0.5, אחת, 1.5, שתיים, 2.5, שלוש וארבע שניות. התווה את ערכי ה- ASTD המתאימים כפונקציה של זמן הרוויה. כעת, הגדר את מספר הסריקות ל-64 וממוצע לולאת הניסוי ארבע פעמים.
לאחר מכן, חשב את המספר הכולל של הסריקות. הגדר את השהיית הסריקה הפנימית לארבע שניות ואת זמן הרכישה ל-2.7262976 שניות. הגדר את דופק הרוויה על ידי הגדרת משך הזמן ל-50 אלפיות השנייה ושליטה בצורת גאוס באמצעות התוכנית המעוצבת 9SP9.
החל מסנן שורה T1 בגרסת STD NMR, ולאחר מכן, הגדר את זמן נעילת הסיבוב D29 בהתבסס על גודל החלבון. כדי למפות את קשירת הליגנד H1 R2, ראשית, בחר את תוכנית הדופק CPMG_ESGP2D מהספרייה הסטנדרטית של Bruker. הגדר את הניסוי כרכישה דו-ממדית.
הגדר את פרמטרי הרכישה כפי שמוצג. לאחר מכן, הפעל את הניסוי במשך 200 מחזורים של שמונה סריקות כל אחד. התאם את רשימת המונה המשתנה בהתאם לזמן הכולל הרצוי של מחזור CPMG.
ערכו שני ניסויים, אחד עבור הדגימה עם החלבון ואחד עבור דגימת הליגנד בלבד. שרטט את ספקטרום H1 עבור כל TCPMG באמצעות הפקודה EFP או סינוס M ואחריו FP, ולאחר מכן התאם את פונקציית החלון בהתאם לאסטרטגיית העיבוד הטובה ביותר. חשב את מנת ה-CPMG Q באמצעות המשוואה.
רכוש ספקטרום H1N15HSQC של CVN עם תווית N15 ב-298 קלווין. טיטראט עם D-מנוז כדי להגיע לריכוזים הסופיים של אפס, אחד, שניים, חמש, 10, 20, 40 ו-60 מילימול. השתמש ברצף דופק HSQC רגיש לפאזה FHSQCF3GPPH מהיר מהספרייה הסטנדרטית של Bruker.
לאחר מכן, חשב את הפרעת ההסטה הכימית באמצעות הנוסחה. התווה ערכי CSP עבור כל שארית כפונקציה של ריכוז D-מנוז כדי לקבוע את קבוע הדיסוציאציה KD באמצעות משוואה חמש. לאחר מכן, התאם את הנתונים המתקבלים לאיזותרמית מחייבת יחידה באמצעות הנוסחה.
השתמש ברצף דופק HSQCT2ETF3GPSI3D רגיש לפאזה והגדר פרמטרים כפי שמוצג כדי למדוד את ערכי N15 R2 של השאריות הבודדות של שאריות CVN בהיעדר ונוכחות של 60 מילי-מולרי D-מנוז ב-298 קלווין. עבד ספקטרום פסאודו-תלת מימדי באמצעות NMRPipe כדי ליצור ספקטרום דמוי HSQC עבור כל עיכוב הרפיה. ייבא את הספקטרום המעובד לפלטפורמת ניתוח.
לאחר מכן, בחר את כל הספקטרום והחל את הכלי לעקוב אחר שינויי עוצמה. שרטט את העוצמה של כל שיא צולב כפונקציה של T להירגע ולהתאים את הדעיכה לפונקציה חד-מעריכית כדי לחלץ ערכי N15 R2 עבור כל שאריות. חשב את השגיאה הניסיונית מיחס האות לרעש של הספקטרום דמוי HSQC ב-67.84 אלפיות השנייה.
עבדו אזור בספקטרום המכיל רעש בלבד והמירו אותו לקובץ טקסט באמצעות הפקודה הנתונה. לאחר מכן, קבע את סטיית התקן של אזור הרעש או עוצמת הרעש באמצעות תוכנה סטטיסטית. חשב את שגיאת הניסוי באמצעות המשוואה הנתונה.
הפרעות בשינוי כימי נצפו עבור שתי הצורות האנומריות של D-מנוז בנוכחות CVN, עם תזוזות גדולות יותר שנצפו בבטא-D-מאנוז, מה שמעיד על קשירה מועדפת. שתי שיאים נבדלים נצפו עבור רוב המימנים D-mannose בנוכחות CVN, המתאימים למצבים חופשיים וקשורים. גרעיני המימן המציגים את ערכי ה-ASTD הגבוהים ביותר היו קשורים לבטא-D-מאנוז, בהתאם לאינטראקציות דו-קוטביות חזקות עם CVN.
בניתוח קצב ההרפיה הרוחבי, H בטא ארבע היה הפרוטון היחיד שהראה עלייה ניכרת בהרפיה בעת הקישור ל-CVN. הפרעות ההיסט הכימי H1 ו-N15 שנגרמו על ידי הוספת ליגנד היו הגבוהות ביותר בריכוז של עד 10 מילי-מולאר. שאריות I40, E41, N42, V43, D44 ו-G45 בתוך גדיל הבטא הראו הפרעות משמעותיות בשינוי כימי, וזיהו אותן כאתר הקישור בעל הזיקה הגבוהה ל-D-מאנוז.
איזותרמיות קשירה הראו כי לשאריות D44 יש את הזיקה הגבוהה ביותר מבין שאריות גדילי הבטא, עם קבוע דיסוציאציה של כמילימול אחד. מדידת שיעורי ההרפיה של N15 R2 הראתה עליות וירידות בערכי דלתא R2 עם קשירת D-מאנוז, מה שמרמז על שילוב של תהליכי ייצוב והחלפה קונפורמטיביים. שאריות C58, R59, K74 ו-R76 הראו ערכי דלתא R2 מוגברים, המאשרים את מעורבותם באתר הקישור בעל הזיקה הגבוהה, בעוד שאריות F4, C8, R24 ו-G27 ייצגו את אזור הזיקה הנמוכה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן אינטראקציות בין חלבונים לגליקנים, תוך דגש על קומפלקס האינטגרין-דיסאינטגרין. הוא בוחן את הדינמיקה המבנית ואת תפקידן של כוחות השטח בתיווך היווצרות הקומפלקס ויציבותו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- ביולוגיה מבנית
רקע
- אינטראקציות חלבוניות חלשות הן קריטיות לתפקודים ביולוגיים.
- קיימת נטייה לחקור קומפלקסים בעלי זיקה (affinity) גבוהה.
- כוחות פני שטח ממלאים תפקיד משמעותי בזיהוי מולקולרי.
- צבירי הידרופוביות בחלבונים משפיעים על האבולוציה של אתרי קישור.
מטרת המחקר
- לחקר הדינמיקה של אינטראקציות בין חלבון לגליקאן.
- להבנת תפקידן של כוחות פני שטח ביציבות האינטראקציה.
- לשימוש ב-NMR לזיהוי אינטראקציות חלבוניות חלשות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקות מבוססות NMR לחקר אינטראקציות.
- מיפוי של אתרי קישור וזיהוי של השפעות אלוסטריות.
- פרוטוקולים להכנת דגימות וניתוח נתונים.
- שילוב של גישות מביולוגיה מבנית.
תוצאות עיקריות
- זיהוי של קומפלקסי מפגש (encounter complexes) באינטראקציות חלבון-גליקן.
- תובנות לגבי היבטים מבניים ודינמיים של קישור.
- מיפוי של אפקטים אלוסטריים בקומפלקסים שנבדקו.
- מידע בעל ערך לאבחונים ספציפיים לגליקנים.
מסקנות
- המחקר משפר את ההבנה של אינטראקציות חלשות בביולוגיה.
- הוא מספק מסגרת למחקר עתידי על זיהוי מולקולרי.
- לממצאים יש השלכות על מנגנוני זיהוי גליקנים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אינטראקציות בין חלבונים לגליקנים הן קריטיות לאיתות תאי, לזיהוי חיסוני ולהתקדמות מחלות, אך אופיין החלש והחולף מציב אתגרים משמעותיים לגילוי תרופות ולפיתוח סממנים ביולוגיים. פרוטוקולי NMR מתקדמים מאפשרים כיום מיפוי ברזולוציה אטומית של אינטראקציות אלו, ובכך תומכים בביטחון חיזוי בתיקוף מטרה ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי גילוי מוקדמים. יכולת זו משפרת את קבלת ההחלטות בנוגע לתיק הפיתוח על ידי חשיפת אירועי קישור בעלי זיקה נמוכה, שלעיתים קרובות מוחמצים בשיטות סריקה מסורתיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ברמה אטומית של אתרי זיהוי בין חלבון לגליקאן לצורך תיקוף פונקציונלי של מטרות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבחנה בין אזורי קישור בעלי זיקה גבוהה לנמוכה בתוך מטרות מועמדות.
- מסייע בזיהוי השפעות אלוסטריות וקומפלקסי מפגש הרלוונטיים למסלולי איתות ביולוגיים.
- משפר את הביטחון החזוי להקדמת נכסים המכוונים לגליקנים בצינור הגילוי.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק בדיקות מבוססות NMR סטנדרטיות וניתנות לשחזור לכימות אינטראקציות חלשות בין חלבונים לגליקנים.
- מספק תוצאות כמותיות, כגון שינויים בהסחה כימית (chemical shift perturbations) וקבועי דיסוציאציה, לצורך פיתוח בדיקות חסונות.
- מאפשר זיהוי של קומפלקסים חולפים ובעלי זיקה נמוכה, ובכך מרחיב את היקף מסעות הסריקה.
- תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה עבור מגוון מטרים של חלבונים קושרים גליקנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם סממנים ביולוגיים של גליקנים הרלוונטיים למחלה, להבטחת רצף תרגומי משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מבוסס ניהול סיכונים על ידי הבהרת הרלוונטיות הביולוגית של אינטראקציות חלשות.
- תומך בזיהוי של סממנים אבחנתיים חדשים המבוססים על זיהוי ספציפי לגליקנים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
פרוטוקול NMR זה משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף מוקדם של המטרה דרך פיתוח בדיקות ומחקר תרגומי, ומספק פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לאפיון אינטראקציות בין חלבונים לגליקנים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות מיפוי אתרי קישור ודינמיקת אינטראקציה.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור להשוואת זיקות של ליגנדים ואופני קישור.
- אנליזה: מספקת נתוני chemical shift, רלקסציה והעברת רוויה (saturation transfer) לצורך ניתוח סטטיסטי חסון.
- מחקר תרגומי: מקשרת אירועי זיהוי מולקולריים לסמנים ביולוגיים רלוונטיים למחלה ולאסטרטגיות אבחוניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה תהליך עבודה סטנדרטי הניתן להתאמה למערכותโปรטאין-גליקן מגוונות בתוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של בדיקות אינטראקציה חלשה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות משופרת לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ויעילות הון על ידי הבהרת הרלוונטיות של קישור בעל זיקה נמוכה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של נכסים המכוונים לגליקנים.
שיקולי יישום
- ביצוע הפרוטוקול ופירוש הנתונים דורשים מומחיות בספקטרוסקופיית NMR ובביולוגיה מבנית.
- נדרשת גישה למכשור NMR בשדה גבוה ולתוכנה אנליטית מתקדמת לעיבוד ספקטרלי.
- השגת תוצאות הניתנות לשחזור מחייבת הכנת דגימות קפדנית ובקרת ריכוזים.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה של פרמטרי הרכישה עבור מערכות חלבון-גליקן שונות או עבור זיקות קישור שונות.
- השיטה מוגבלת על ידי הרגישות והתפוקה של ה-NMR בהשוואה לפלטפורמות של סריקה בתופוקה גבוהה (high-throughput screening).
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:12
Mapping Ligand‐Protein Interactions Using Chemical Shift Perturbation, Saturation Transfer Difference, and Relaxation NMR Techniques
5:28
Mapping the Binding of D‐Mannose on CVN by Chemical Shift Perturbation of the Protein
6:26
Mapping the Binding of D‐Mannose on CVN via the 15N‐R2 Position of the Protein
7:58
Results
