כריתת לימפאדנקטומיה מזנטרית של עכברים לשיבוש סלקטיבי בתקשורת לימפה עם מערכת העיכול הספציפית לאזור
30 בדצמבר 2025
פרוטוקול זה מתאר הליך הישרדות עבור לימפאדנקטומיה מזנטרית של עכברים בטוחה ונסבלת היטב, בכל אחת מארבע תחנות לאורך שרשרת בלוטות הלימפה המזנטריות. הליך זה ניתן להתאמה כדי לאפשר הפרעה סלקטיבית בתקשורת הלימפה עם המעי הגס הדיסטלי, המעי הגס הפרוקסימלי ו/או המעי הדק.
המחקר שלנו מתמקד בתגובות תאי T לנאואנטיגנים ולרקמות היקפיות, והתגובות הללו מושפעות מאוד מפריימינג, ולכן אנו מתמקדים בעיקר במקום שבו מתרחשים אירועי הפריימינג הללו. כיום, האפשרויות הנפוצות היחידות לחסימת התנועה בין בלוטות לימפה לרקמות הן מודאליות מערכתית כמו אגוניסטים לקולטני S1P וחסימת האינטגרין. אך עיכוב רחב זה מונע מאיתנו לחקור את תרומתן של בלוטות לימפה מקומיות ספציפיות.
הפרוטוקול שלנו מספק תיאור מעמיק של לימפאדנקטומיות סלקטיביות מאוד בכל אחת מארבעת תחנות הלימפה המזנטריות המרכזיות, ומכיוון שבלוטות הלימפה הללו מתמחות מאוד במקטע המעי שהן מנקזות, הליך הישרדות זה מאפשר לנו לשבש מקטעים מסוימים בציר הלימפה של המעי תוך השארת השאר שלמים. לאחר אישור עומק ההרדמה המתאים באמצעות צביטה בכף הרגל האחורית, השתמשו במספריים ניתוחיים סטריליים כדי לבצע חתך עור בקו אמצע של 0.5 עד 1 סנטימטר בעכבר המורדם. באמצעות מלקחיים סטריליים, נתח את העור הרחק מדופן הבטן וזהה את הלינאה אלבה.
לאחר מכן לבצע חתך נוסף של 0.5 עד 1 סנטימטר דרך הלינאה אלבה כדי להגיע לחלל הפריטונאלי. באמצעות מחט קהה, החדרו מיליליטר אחד של מי מלח סטריליים לטמפרטורת הגוף לחלל הפריטונאלי. הרטיב את הווילונות הסטריליים כדי להתכונן למיקום המעיים.
כדי לכרות את תחנת בלוטת הלימפה הראשונה, יש לכוון את המעי החיצוני אל וילונות לחים כאשר הצקום ממוקם תחתון, המעי הגס הפרוקסימלי כלפי מעלה, והאילאום הסופי לכיוון המנתח. זהה את שרשרת בלוטות הלימפה המזנטריות שרצה לאורך המעי הגס. באמצעות מלקחיים עם קצה דק בזווית, נתח בצורה ישירה את תחנת בלוטת הלימפה הראשונה הרחק מכלי הדם האילאוקוליים על ידי הנחת המלקחיים הסגורים בין המבנים הללו ופתיחתם בעדינות.
כדי להפחית את הסיכון התיאורטי לזרימה צדדית לקשרים סמוכים, יש לבצע קשירת תפר אופציונלית עם תפרים בודדים מופרעים לאורך שרשרת בלוטת הלימפה, מילימטר אחד דיסטלי ומילימטר פרוקסימלי אחד לתחנת בלוטת הלימפה הראשונה, באמצעות תפר ניילון מונופילמנט ומלקצים דקים. משכו בעדינות את תחנת בלוטת הלימפה בזנב, ואז באמצעות מספריים דקים, חתכו את תחנת בלוטת הלימפה היעד מהראש לכיוון הזנב. התבוננו בענפים הרחוקים של כלי האילאוקול, הכלי האיליאלי וכלי הדם הג'ונלי כדי לוודא שאספקת הדם נשארת שלמה.
כדי לכרות את תחנת הלימפה השנייה, יש לפרק בעדינות את המעי הדק ולכוון את המעי החיצוני אל וילונות לחים, כאשר הצקום ממוקם תחתון, המעי הגס הפרוקסימלי כלפי מעלה, והמעי הדק לכיוון ימין של המנתח. לאחר מכן, זהו את תחנת בלוטת הלימפה השנייה שרצה לאורך המעי הגס ומתחילה במפגש כלי הדם האיליאליים והג'ונליים. באמצעות מלקחיים עם קצה דק בזווית, נתח באופן ישיר את תחנת בלוטת הלימפה השנייה הרחק מכלי המעי הגס.
כדי להפחית את הסיכון התיאורטי לזרימה צדדית לקשרים סמוכים, יש לבצע קשירת תפר אופציונלית עם תפרים בודדים מופרעים לאורך שרשרת בלוטת הלימפה, מילימטר אחד מרחוק ומילימטר פרוקסימלי לתחנת הבלוטה הלימפה השנייה, באמצעות תפר ניילון מונופילמנט ומלקחיים דקים. משכו בעדינות את תחנת בלוטת הלימפה בזנב, ואז באמצעות מספריים דקים, והסיקו את תחנת בלוטת הלימפה השנייה מהראש לכיוון הזנב. בדוק את שדה הפעולה כדי לוודא המוסטזיס.
כדי לכרות את תחנת בלוטת הלימפה הרביעית, יש לפרק בעדינות את כל המעי הדק עד לנקודת הקשירה האחורית. כוון את המעי על וילונות רטובים כאשר הצקום תחתון, המעי הגס הפרוקסימלי כלפי מעלה, והמעי הדק לכיוון ימין של המנתח. זהה את תחנת בלוטת הלימפה הרביעית שנמצאת ממש מדיאלי למעי הגס הדיסטלי ולטרל לתחנה השלישית.
באמצעות מלקחיים דקים בזווית או מספריים דקים במיוחד, נתחו בצורה ישירה את תחנת בלוטת הלימפה הרביעית הרחק מכלי המעי הגס ומרקמת השומן הסובבת. כדי להפחית את הסיכון התיאורטי לזרימה צדדית לקשרים סמוכים, יש לבצע קשירת תפר אופציונלית עם תפרים בודדים מופרעים בכל בלוטת לימפה מזוהה, בדרך כלל במרחק מילימטר אחד מהצומת, באמצעות תפר ניילון מונופילמנט ומלקחיים דקים. לאחר מכן משכו בעדינות את תחנת הלימפה הרביעית בראש.
באמצעות מספריים דקים או דקים במיוחד, מחלקים את תחנות בלוטת הלימפה מהזנב לראש. חזור על ההליך עבור הצומת השנייה בתחנת בלוטת הלימפה הרביעית. לנתח בזהירות את הצומת, לבצע קשירת תפרים במידת הצורך, ולכרת אותו.
בדוק את שדה הניתוח כדי לאשר המוסטזיס. לאחר החזרת תכולת הבטן לחלל הפריטונאלי, יש להחדיר מיליליטר אחד של סליין סטרילי בטמפרטורת גוף לחלל הבטן כדי לפצות על אובדן נוזל אידוי. סגור את הבטן בשתי שכבות: תחילה דופן הבטן, ואז העור באמצעות תפר פוליפרופילן מונופילמנט 6-0 בתבנית רצינית.
רקמה שנלקחה באמצעות הליך הלימפאדנקטומיה המזנטרית הובילה בעקביות לדגימות עם תכולת שומן נמוכה, כפי שניתן לראות בשקיעה מיידית ב-PBS. ניתוח ציטומטריית זרימה אישר חילוץ מוצלח של בלוטות לימפה, כאשר למעלה מ-95% מהתאים בדגימות שמקורן במזנטריות זוהו כחיוביים ל-CD45, לעומת 7% בלבד בביקורת רקמת שומן ויסרלית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לכריתה סלקטיבית של קשרי לימפה מזנטריים בעכברים, המאפשרת הסרה ממוקדת של תחנות ספציפיות של קשרי לימפה מזנטריים. הטכניקה מאפשרת לחוקרים לנתק את התקשורת הלימפטית עם מקטעי מעי מוגדרים, ובכך להקל על מחקרים הנוגעים לתפקידיהם הייחודיים של קשרי לימפה מקומיים לעומת מערכיים בהפעלת תאי T ובאימונולוגיה של המעי. ההליך תוכנן כדי להבטיח שיעורי הישרדות גבוהים ועיבוד מיידי של הרקמות לאחר מכן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- גסטרואנטרולוגיה
- טכניקות ניתוחיות במודלים של בעלי חיים
רקע
- ניטור חיסוני (Immunosurveillance) וסבילות לאנטיגן במעי תלויים באיזון בתוך המיקרו-סביבה המקומית.
- הפעלה (priming) של תאי T במחזור הדם בקשרי לימפה היא תהליך מבוסס היטב, אך לתאי T שאינם במחזור הדם בקשרי לימפה מנקזים עשויים להיות תפקידים ייחודיים שאינם חופפים.
- ניקוז הלימפה מהמעי הוא ספציפי מאוד למקטע, מה שמחייב גישות ניסיוניות מדויקות.
- שיטות סיסטמיות קיימות לחסימת התנועה בין קשרי לימפה לרקמות חסרות ספציפיות לקשרי לימפה מקומיים.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול ניתוחי הניתן לשחזור, המבטיח הישרדות, להסרה סלקטיבית של תחנות קשריות לימפה מזנטריות בעכברים.
- לאפשר שיבוש ממוקד של הניקוז הלימפטי מהמעי הגס הדיסטלי, המעי הגס הפרוקסימלי ו/או המעי הדק.
- להקל על מחקרים המבחינים בין תרומתן של קשריות לימפה מקומיות לעומת סיסטמיות לתגובות חיסוניות במעי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח הישרדות תחת הרדמה עם חיתוכים בקו האמצע של הבטן.
- זיהוי ודיסקציה קהה של תחנות ספציפיות של קשרי לימפה מזנטריים באמצעות פינצטה ומספריים בעלי קצה דק.
- ליגציה אופציונלית בתפירה להפחתת זרימה לימפתית קולטרלית.
- כריתה זהירה של תחנות קשרי הלימפה תוך שמירה על אספקת הדם והמוסטזיס.
- סגירה לאחר הניתוח בשתי שכבות והשלמת נוזלים.
- אימות של השליפה של קשרי הלימפה באמצעות ציטומטריה של זרימה (העשרה של תאי CD45+) ובדיקת ציפה של הרקמה ב-PBS.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מניב דגימות של קשרי לימפה עם זיהום מינימלי של רקמה שומנית, כפי שניתן לראות מהשקיעה המיידית ב-PBS.
- ציטומטריית זרימה מעידה על למעלה מ-95% תאי CD45+ בדגימות שהופקו מלימפדקטומיה (lymphadenectomy), לעומת 7% בלבד בביקורות של רקמה שומנית ויסcerלית.
- ההליך נסבל היטב וניתן להתאמה לשיבוש סלקטיבי של ניקוז לימפטי ממקטעי מעי ספציפיים.
- פתרון בעיות מפורט ועזרים חזותיים משפרים את השחזוריות ואת שיעורי ההישרדות.
מסקנות
- פרוטוקול זה מאפשר שיבוש מדויק וסגמנטלי של ניקוז הלימפה במעי במודלים של עכברים.
- הוא תומך במחקרים על התפקידים המובחנים של קשרי לימפה מקומיים לעומת סיסטמיים בוויסות החיסוני של המעי.
- השיטה מספקת דגימות איכותיות של קשרי לימפה המתאימות לאנליזות אימונולוגיות המשך.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
כריתה סלקטיבית של קשרי לימפה מזנטריים בעכברים מאפשרת שיבוש מדויק של התקשורת הלימפתית עם מקטעים ספציפיים של המעי, ובכך תומכת ישירות בהסרת סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי הממוקדים באימונולוגיה. יכולת זו מאפשרת לצוותים בביופארמה לבחון את התפקידים הייחודיים של קשרי לימפה מקומיים לעומת סיסטמיים בהפעלת תאי T ובבקרת מערכת החיסון במעי, דבר המסייע בתיקוף מטרות ובאסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים. השחזוריות וההתניידות של הפרוטוקול מציבות אותו כפלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר למחקרים פרה-קליניים באימונולוגיה ובמחלות מעי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ניתוח פונקציונלי של תרומות קשרי לימפה מקומיים לעומת סיסטמיים לתגובות חיסוניות.
- תומך בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי בידוד נתיבים לימפטיים ספציפיים לאזור במודלים של המעי.
- מקל על ביצוע מחקרים מונחי-השערה על הפעלת תאי T (T cell priming) והשגחה חיסונית במקטעי מעי מוגדרים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק דגימות קשריות לימפה מאושרות ודלות בשומן לבדיקות אימונולוגיות המשך.
- מסטנדרט את הפקת הרקמה לקבלת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, כגון זרימה ציטומטרית (flow cytometry).
- מכין מערכות ביולוגיות להערכה מהימנה של תרכובות מווסתות מערכת חיסון.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים פרה-קליניים לסגמנטים של המעי הרלוונטיים למחלה לצורך רציפות תרגומית.
- מאפשרת קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים באמצעות הבהרת מנגנונים חיסוניים מקומיים.
- תומכת בגילוי של סמנים ביולוגיים על ידי בידוד אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון ומערכת הלימפה המובחנות אזורית.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לשיבוש לימפתי סלקטיבי, ובכך הוא תומך הן במחקרים מכניסטיים והן בפיתוח מודלים תרגומיים.
- ביולוגיה של גילוי: מקלה על בדיקת השערות הנוגעות לוויסות חיסוני מקומי ולסגוליות של מסלולים במעי.
- סריקה: מספקת דגימות קשריות לימפה בעלות טוהר גבוה וניתנות לשחזור עבור קריאות אימונולוגיות כמותיות.
- אנליזה: תומכת בציטומטריה של זרימה ובניתוחים תאיים אחרים להשוואת אוכלוסיות של תאי חיסון בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאי גילוי למודלים פרה-קליניים באמצעות מניפולציה לימפתית ספציפית לאזור.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להתאמה למגוון מחקרים באימונולוגיה של המעי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במחקרי מנגנוני חיסון ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה של הוצאת קשרי לימפה ובדיקות המשך.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go על ידי הבהרת תרומות חיסוניות מקומיות לעומת סיסטמיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של תוכניות אימונולוגיה המכוונות למעי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות ניתוח בעכברים ובנהלי סטריליזציה.
- נדרשת גישה למכשור ניתוחי עדין ולתשתית של ציטומטריה של זרימה לצורך תיקוף.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח איכות דגימות עקבית והדירות.
- ניתן להתאים למקטעים שונים של המעי, אך השימוש מוגבל למודלים של עכברים כמתואר.
- פוטנציאל לזרימה לימפטית נלווית מחייב קשירה בחוטי תפירה (Suture ligation) אופציונלית להשגת ספציפיות מקסימלית.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:02
Mesenteric Lymphadenectomy and Excision of the First Lymph Node Station (Proximal Colon Drainage)
3:13
Excision of the Second Lymph Node Station (Mid-Distal Small Intestine Drainage)
4:39
Excision of the Fourth Lymph Node Station (Distal Colon Drainage)
6:16
Mesenteric Lymphadenectomy Completion
6:45
Results
