עריכה גנומית משופרת באמצעות חומצות גרעין ביציות מבוססת טכניקת אלקטרופורציה In Vivo ליצירת עכברי נוקאאוט

היקף המחקר שלנו הוא לפשט את יצירת עכברי ההרה באמצעות שימוש באלקטרופורציה ברחם, תוך העברת רכיבי עריכת גנום ישירות לצינורות הביצים של נשים בהריון. הזרקות מיקרו לזיגוטים דורשות שמירה על מספר רב של בעלי חיים, כולל נקבות תורמות ומקבלות וזכרים שעברו וסקטומיה. לכן, פרוטוקולים שממזערים את השימוש בבעלי חיים הם מועדפים.

השימוש במערכת Nepa21 לאלקטרופורציה של זיגוטות מספק הזדמנות ייחודית לייצר עכברי הדחפה גנטיים ממוקדים בשלב אחד, ביעילות השווה לטכניקות הזרקה גרעינית סטנדרטיות. בתחילה, השתמשו בכלי ניתוח חישובי לזיהוי רצפי RNA חד-מנחה פוטנציאליים המכוונים לגן הנבחר. בחר רצפים הממוקמים באקסונים הקרובים ככל האפשר לאתר המוטציה הרצוי. השתמש בדפדפן גנום כדי להצליב את מבנה האקסום ולתעדף רצפים הנמצאים ברוב איזופורמי החיבור.

נתחו את הפעילות החזויה של כל רצף מדריך באמצעות מערכת הניקוד המשולבת של הכלי. בחר רצפים שמראים את הסבירות הנמוכה ביותר לקישור מחוץ למטרה. כדי להפיק תבנית DNA ליניארית דו-גדילית, יש להכין את תערובת המאסטר של PCR באמצעות הרכיבים המפורטים בטבלה הנתונה.

הוסף את הפולימראז אחרון והשאיר את התערובת הראשית על קרח כדי לשמור על יציבות אנזימטית. לאחר מכן, הריץ את ה-PCR בהתאם לתנאי המחזור התרמי הבאים. לאחר מכן, הכינו את תערובת המאסטר של השעתוק במבחנה באמצעות הרכיבים הניתנים ודגרו את התגובה למשך שעה וחצי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמצעות תרמחזור לשליטה עקבית בטמפרטורה.

לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של DNase I לתגובה. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות לעיכול תבנית ה-DNA, ואז השביתו את האנזים בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר טיהור TRIzol של RNA, יש למדוד את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר ולבדוק את היחס בין A260 ל-A280 ו-A260 ל-A230.

כדי להכין את קומפלקס הריבונוקלאופרוטאין לטרנספקציה, יש לדלל בופר טריס-HCl מולר אחד לריכוז של 100 מילימולר באמצעות מים נטולי נוקלאז. סנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרק עם גודל נקבובית של 0.022 מיקרומטר. מחלקים Aliquot למנות של 10 מיקרוליטר ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס עד השימוש.

לאחר מכן, הכינו את תערובת הטרנספקציה באמצעות spCas9 נוקלאז, RNA מדריך יחיד ו-Tris-HCl מדוללים במי DEPC בצינור נטול נוקלאז. דגרו את תערובת הטרנספקציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לאפשר היווצרות קומפלקס הריבונוקליאופרוטאינ. לאחר מכן, מחלקים את תערובת הטרנספקציה לנפחים קטנים המתאימים לסשנים בודדים של I-GONAD ושומרים עליה בארבע מעלות צלזיוס לשימור פעילות המגיב (reagent).

לאחר הזדווגות נקבות CD1 עם עכברים זכרים חד-ביתיים CD1 במהלך הלילה, יש לבדוק כל נקבה לנוכחות פקק הזדווגות. העבר רק את הנקבות עם פקקים גלויים לכלוב חדש לצורך הליכים ניסיוניים נוספים. אוטוקלב לכל כלי הניתוח מנירוסטה כדי להבטיח סטריליות לפני השימוש.

לאחר מכן, שקלו את הפלאג הנבחר = עכברים נקבות חיוביים באמצעות משקל אלקטרוני לפני ההרדמה. עקבו אחרי העכברים המורדמים לאיתור אובדן רפלקס הצביטה של האצבע כדי לוודא הרדמה מספקת. הנח את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך התהליך.

לאחר מכן, מרחו משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש. באמצעות מספריים עדינים, יש לבצע חתך אורכי של 0.7 סנטימטר בעור באזור הגב התחתון. לאחר מכן, פשטו לרוחב את קצות המספריים הפתוחים מעט כדי להאריך בעדינות את חתך העור לכ-1.3 סנטימטרים.

לאחר מכן, בצע בזהירות חתך של 0.7 סנטימטר בפריטונאום כדי לחשוף את חלל הבטן. האריך את החתך הפריטוניאלי ל-1.1 סנטימטרים, תוך דחיפה דו-צדדית עם קצות מספריים פתוחים מעט. מצאו את כרית השומן המחוברת לשחלה ומשכו אותה בעדינות החוצה באמצעות מלקחיים עד שהשחלה, צינור הביצים והרחם נחשפים.

באמצעות מהדק כלי דם, אבטח את כרית השומן לייצוב מבני הרבייה. לאחר מכן, טען שני מיקרוליטרים מתערובת הזרקת ריבונוקלאופרוטאין לתוך נימי פלסטיק חד-פעמי באמצעות פיפטר סטריפ. באמצעות מספריים מיקרו, בצע חתך באורך 0.2 סנטימטר בדופן הצינור כמה מילימטרים מעלה האמפולה.

הכנס את הנימים הפלסטיים המחוברים לפיפטר לתוך חתך בצינור הביצים ושחררו בזהירות את תערובת ההזרקה מבלי להכניס אוויר. משכו בעדינות את הנימים הפלסטיים מצינור הביצים כדי להשלים את ההזרקה. הפעל את האלקטרופורטור על ידי לחיצה על מתג ההפעלה בלוח הקדמי.

הגדר את פרמטרי האלקטרופורציה במכשיר כפי שמוצג על המסך. באמצעות אלקטרודות מסוג פינצטה, אחזו בעדינות בצינור הביצים ולחצו על כפתור הקילוהם כדי למדוד את ההתנגדות. מיד לאחר מדידת ההתנגדות, לחץ על כפתור ההתחלה כדי להתחיל באלקטרופורציה והמתין לאות הסיום שיופיע על כפתור האוהם.

לאחר האלקטרופורציה של צינור הביצים הראשון, מחזירים בעדינות את מערכת הרבייה לחלל הבטן. סגרו את החתך באמצעות תפר כירורגי 4-0 פוליגליקולית חומצה. לגנוטיפינג, תכננו 18 עד 21 פריימרים ארוכים בנוקלאוטידים עם טמפרטורת התכה בסביבות 60 מעלות צלזיוס ליצירת מוצר PCR של 300 עד 600 זוגות בסיסים.

כדי לאשר את הספציפיות של כל פריימר, יש לבצע חיפוש BLAST במאגר הגנום של העכבר כדי למנוע את הסיכון להגברה לא ספציפית. לאחר מכן, לצורך חילוץ DNA, באמצעות מאגר אוזן, אספו דגימת רקמה קטנה בגודל של כ-2 מילימטרים מאוזן העכבר. הוסיפו 100 מיקרוליטר של בופר ליזיס.

דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות, תוך מערבולת כל 20 דקות כדי להבטיח פירוק יעיל. לאחר ביצוע ריצוף סנגר, נתח את התוצאות כדי להעריך תוצאות עריכת הגנום. כדי להשתמש בניתוח ICE, העלה את שני קבצי הריצוף של סנגר, הזן את רצף ה-RNA המנחה, ובחר את הגרעין המתאים ששימש בניסוי CRISPR.

לאחר מכן, כדי להשתמש ב-TIDE, העלה את קבצי הבקרה והרצף הניסיוני בפורמט AB1 והזן את רצף ה-RNA המנחה. ניתוח ICE זיהה שלושה וריאנטים מובחנים של אינדל באתר החיתוך של Cas9, מחיקה של זוג בסיס אחד ב-42% מהרצפים, מחיקה של שלושה זוגות בסיסים ב-25% מהרצפים, ומחיקה של 23 זוגות בסיסים ב-27% מהרצפים. ערך ההתאמה של המודל היה 0.94 וציון הנוקאאוט היה 69, מה שמעיד על קורלציה חזקה לחיזוי וסביר לנוקאאוט גנטי.

כרומטוגרמות רצף אישרו הפרעה באתר החיתוך של Cas9 בדגימה הערוכה, בעוד שכרומטוגרמת הביקורת הראתה רצף שלם באותו אתר. מתוך שישה עכברים עם אלקטרופורציה, רק ארבעה יצרו גורים עם מוטציות, מה שהוביל ליעילות עריכה כוללת של 60%. כל הגורים בששת העכברים החשמליים הראו ירידה במספר הגורים, עם רק שלושה עד ארבעה גורים לכל עכבר.