תכנות מחדש של תאי גידול לתאים דמויי תאים דנדריטיים קונבנציונליים מסוג 1

אנו חוקרים תכנות in vivo של תאים סרטניים לתאים דמויי cDC1 כאסטרטגיה אימונותרפית חדשה. אנו שואפים לקבוע אם גישה זו יכולה להמיר גידולי הצטננות חיסונית לחום חיסוני, ובכך להכריז על חסינות נגד גידולים. אנו מתייחסים למגבלות של אסטרטגיות ייצור cDC1 הנוכחיות על ידי הצגת פרוטוקול להמרת תאים סרטניים לתאים דמויי cDC1 אימונוגניים ישירות בתוך הגידול, המאפשר לחקור תגובות חיסוניות מונעות cDC1 באתרן.

פרוטוקול התכנות in vivo הניתן להעברה שלנו מייצר באופן אמין תאים דמויי cDC1 אימונוגניים בוגרים, המתגברים על מיקרו-סביבת הגידול המדכאת, ומכיוון שתאים אלה נוצרים ישירות in vivo, גישה זו מבטלת את הצורך בייצור תאים חיסוניים במבחנה. הממצאים שלנו יוצרים בסיס לתרגום תכנות מחדש בתיווך גורם שעתוק in vivo למרפאה, ומציגים אימונותרפיה מדף אך מותאמת אישית לסרטן המעוררת תגובות חיסוניות עמידות נגד גידולים. בהמשך, אנו חוקרים כיצד תכנות מחדש של תאים דמויי cDC1 יכול לעורר היווצרות שלישונית ותשתית, והאם זה מתורגם לחסינות הומורלית.

בנוסף, אנו בוחנים גם את הסינרגיה הפוטנציאלית שלו עם גישות אימונותרפיות אחרות. כדי להתחיל, תרבית תאי HEK 293T עד שהם מגיעים למפגש של 70 עד 80%. כעת, מערבל את תערובת הטרנספקציה המוכנה המכילה את פלסמיד ההעברה ביסודיות למשך דקה אחת ודגר את התערובת למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר היווצרות קומפלקס שומנים DNA.

שאפו את המדיום מתאי HEK 293T והוסיפו 10 מיליליטר DMEM ללא סטרפטומיצין פניצילין ובתוספת 10% FBS. לאחר מכן, הוסיפו את תערובת הטרנספקציה בטיפה ללוחות 150 מילימטר ודגרו במשך 16 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה, החלף את המדיום ב-20 מיליליטר של מדיום שלם DMEM בתוספת נתרן בוטיראט מילי-מולרי אחד, ודגר את התאים למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט המכיל לנטי-וירוס לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר 48 ו-60 שעות לאחר הטרנספקציה. לאחר האיסוף הראשון, הוסף 12 מיליליטר DMEM שלם שחומם מראש לצלחת 150 מילימטר לבציר השני. סנן את הנוזל שנאסף דרך מסנן פוליאתרסולפון קושר חלבון נמוך של 0.45 מיקרומטר.

פיפטה 37 גרם של המדיום המכיל לנטי-וירוס לתוך צינורות פוליפרופילן בעלי דופן דקה של 38.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינורות ברוטור דלי מתנדנד בטמפרטורה של 25, 000 גרם למשך 90 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.

הנח את צינורות הפוליפרופילן הדקים הפתוחים הפוכים על מגבון מעבדה או חומר סופג דומה למשך חמש דקות כדי לנקז עודפי נוזלים ולייבש את הגלולה. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של DMEM קר כקרח בתוספת HEPES או PBS לכל גלולה והעביר את התערובת לצינור מיקרו-צנטריפוגה המונח בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. דגרו את הגלולה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר השעיה מלאה.

שלבו את כל הכדורים המרחפים למיכל אחד, קבעו את המלאי הנגיפי לנפחים קטנים יותר בין 50 ל-200 מיקרוליטר, ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש ארוך טווח. לאחר התרחבות תאים סרטניים, הכינו את תרחיפי התאים להתמרה כדי להשיג יחס של כמעט אחד לאחד בין תאים חיוביים ל-EGFP שליליים ביום השלישי. הוסף שמונה מיקרוגרם למיליליטר פוליברן לתרחיף התא, ואחריו את הנפח המתאים של לנטי-וירוס, כפי שנקבע קודם לכן.

מערבבים את התוכן בעדינות מבלי ליצור בועות. כעת, פיפטה שני מיליליטר של תרחיף התאים המוכן המכיל אחד כפול 10 בחזקת חמישה תאים לכל באר של צלחת תרבית רקמה בת שש בארות ודגירה למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות, הסר את המדיום המכיל lentivirus מכל באר.

שוטפים את הבארות פעמיים עם PBS. מוסיפים 500 מיקרוליטר טריפסין לכל באר ודוגרים במשך חמש עד 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, בחנו את הבארות תחת מיקרוסקופ אור כדי לאשר ניתוק מוחלט של התאים מהצלחת.

לאחר מכן, אסוף את התאים באמצעות מדיה שלמה לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים למשך חמש דקות ב-350 גרם כדי לגלול אותם. שוטפים את הגלולה עם PBS.

קח אליקוט והעריך את ספירת התאים בת קיימא באמצעות המוציטומטר וצביעה כחולה טריפאן. לאחר מכן, השעו מחדש את כדור התא הסופי ב-PBS קר כקרח כדי להשיג ריכוז של שניים עד ארבעה כפול 10 בחזקת שבעה תאים למיליליטר, המתאים לאחד עד שניים כפול 10 בחזקת שישה תאים ב-50 מיקרוליטר לגידול. הניחו את התאים על קרח ועברו לאזור הניסויים בבעלי חיים.

לאחר הרדמת עכבר CD45.1, הנח אותו על כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה. מרחו קרם עיניים על העכבר כדי למנוע התייבשות בעיניים בזמן ההרדמה. בעזרת סכין גילוח יש לגלח את הצד הימני של העכבר.

לחלופין, סמן את העכבר עם קוצץ אוזניים. יש לחטא את האזור המגולח ולהסיר את שאריות השיער בעזרת ספוגית טבולה באתנול של 70%. כעת, באמצעות פיפטה P1000, השעו מחדש את תאי הסרטן ביסודיות.

טען את מתלה התא התלוי במלואו למזרק של 0.5 מיליליטר המצויד במחט בגודל 30. הרם בעדינות את העור בצד המגולח של העכבר באמצעות שתי אצבעות והכנס את קצה מחט המזרק לקפל שנוצר על ידי העור המורם. שחרר את העור המורם תוך החזקת המזרק במקומו ביד אחת.

השתמש ביד השנייה כדי למתוח את החלק העליון של העור בשתי אצבעות. הזריק לאט 50 מיקרוליטר מתרחיף התאים הסרטניים כדי ליצור נפיחות תת עורית בצורת אליפסה גלויה במקום ההזרקה. לאחר הליך ההזרקה, יש לעקוב אחר החיה עד שהיא מתעוררת לחלוטין מההרדמה כדי להבטיח הישרדות.

תאי HEK 293T שהועברו עם פלסמיד SFFV-PIB-eGFP הראו ביטוי eGFP ברור 24 שעות לאחר הטרנספקציה, מה שאישר אספקת פלזמה מוצלחת. 72 שעות לאחר הטרנסדוקציה, תאי מלנומה הצביעו על אספקה מוצלחת של גורמי התכנות מחדש ו-eGFP. ביום התשיעי לאחר השתלת התאים, תכנות מחדש in vivo הניב אחוז גבוה יותר של תאים חיוביים ל-CD45, חיוביים ל-MHC-II, דמויי cDC1 שתוכנתו מחדש במלואם מאשר בתנאי מבחנה.

ביום השלישי לאחר ההשתלה, גידולי PIB-eGFP הראו חדירת תאי חיסון חיוביים ל-CD45 באופן ניכר מאשר בקרות eGFP, מה שמעיד על עיצוב מחדש מוקדם של מערכת החיסון. ביום התשיעי, עוצמת הקרינה הממוצעת CD45 לאזור הגידול נותרה גבוהה משמעותית בגידולי PIB-eGFP מאשר בביקורת. מבנים לימפואידים שלישוניים הפכו לניתנים לזיהוי בגידולי PIB-eGFP ביום התשיעי, מה שמעיד על שינויים חיסוניים מבניים במיקרו-סביבת הגידול.