אופטימיזציה מהירה של מערכת השראת אור לשליטה בביטוי גנים של יונקים

הפרויקט הזה שואף לפתח שיטה בעלת תפוקה גבוהה לאופטימיזציה ואפיון של כלי אופטוגנטי רב-רכיבי הנקרא LACE לביטוי גנים ביונקים. כדי להתחיל, הניחו בקבוק תרבית תאים המכיל תאי HEK 293 T בתוך ארון בטיחות ביולוגית. השתמש בפיפטה סרולוגית לשאיפת המדיה המנוצלת.

פיפט 10 מיליליטר DPBS לפינה אחת של הבקבוקון וסובב בעדינות כדי לשטוף את התאים. לאחר מכן שואף את תמיסת השטיפה וזרקו את ה-DPBS והשאיבר למיכל הפסולת. עכשיו הוסיפו 1.5 מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA לבקבוק כדי לכסות את פני השטח, ולדגר.

הקישו בעדינות על הבקבוקון כדי לשחרר את התאים מהשטח. לאחר מכן, הפיפטה של 8.5 מיליליטר DMEM טרי לתוך הבקבוק. שואף את התמיסה למעלה ולמטה עד שאין אגרגטים נראים כדי להחזיר את התאים.

לאחר מכן מעבירים תשעה מיליליטרים של מתליית התא לצינור קוני של 15 מיליליטר. הוסף תשעה מיליליטר DMEM טרי לבקבוק. דגרו את המתלה עד למפגש תחת 5% פחמן דו-חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

כעת, מערבבים 10 מיקרוליטר מהתאים המושפים עם 10 מיקרוליטר צבע טריפסין ביחס אחד לאחד כדי לחשב את ריכוז התאים באמצעות המוציטומטר. זרעו כ-35,000 תאים ב-100 מיקרוליטר בכל באר של פלטת זכוכית בעלת ביצועים גבוהים-1.5, שחורה, 96 בארות. הכניסו את הפלטה לאינקובטור עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 24 שעות.

לצורך טרנספקציה, תחילה אחבר 11 מיקרוליטר DMEM חם ללא סרום לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר לבאר אחת ו-10% עודף. הכינו יחס מסה פלסמידיים שונים של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר ב-CRY2 ל-RNA/Aliquot מדריך CIBN של 110 ננוגרם לכל באר של התמיסות המוכנות לכל צינור המכיל את האליקוות המדיום ללא סרום. לאחר מכן פיפטה של 11 מיקרוליטר נוספים של DMEM ללא סרום לכל באר לצינורות נפרדים לדילול תגובת טרנספקציה.

הוסיפו את תגובת הטרנספקציה המדוללת לתערובת ה-DNA ודגרו ליצירת קומפלקסי הטרנספקציה. לאחר מכן פיפטה של 20 מיקרוליטר של קומפלקס הטרנספקציה המוכן לכל באר בלוח 96 בארות המכיל את תאי HEK 293 T. עטוף את לוח ה-96 בארות בנייר אלומיניום והנח אותו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו-חמצני למשך 24 שעות.

כדי להתחיל את תהליך ההפעלה, שנו את קוד הקלט של המיקרו-בקר כדי להאיר את הבארות הרצויות באמצעות קווי הסקריפט שנקבעו. הגדר את עוצמת הדיודה פולטת האור ל-9.27 מיליוואט לסנטימטר רבוע באמצעות קווי הקוד המצוינים. כוון את אורך הפולס לשנייה אחת, ואז הגדר את תדר הפולס ל-0.067 הרץ, שווה ערך לכל 15 שניות.

רססו את המכסה המודפס בתלת-ממד של ה-optoPlate ב-70% אתנול. ואז תן לה להתייבש בארון בטיחות ביולוגית. עכשיו, תדליק מנורת אור אדומה בחדר החושך.

הכניסו את פלטת 96 הבארות בארון הבטיחות הביולוגית. החלף את מכסה הפלטה במכסה המודפס התלת-ממדי היבש. הניחו את פלטת 96 הבארים על מערך ה-LED כדי להרכיב את מערכת ההפעלה.

הניחו את מערך ה-LED המורכב במלואו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 24 שעות. חבר את המיקרו-בקר, דיודה פולטת אור ויציאות מאוורר למקור כוח. כדי לבצע ציטומטריית זרימה, הרץ את תוכנית ההפעלה של המערכת על תוכנת מומחה האתר.

טען שני מיליליטרים של מים דה-יוניים לתוך מעמיס הדגימות. הרץ בקרת איכות באמצעות חרוזי בקרת האיכות שסופקו. הגדר והגדר את בארות הדגימה לרכישה.

צור את הגרפים והטבלאות עבור פיזור צד לעומת פיזור קדימה, גובה פיזור צד לעומת אזור פיזור צדדי, שטח פיזור צד לעומת FITC-A, וטבלת סטטיסטיקות FITC-A. עכשיו, חבר את פלטת ה-V-bottom 960 באר למעמיס הלוחות של הציטומטר. בחר באר לא מועברת ולחץ על Initialize, ואחריו Run.

כוונו את הפיזור הצדדי ואת מתחי FITC כך שמרכז את האוכלוסייה הרלוונטית בגרף SSC-A מול FSC-A. לחץ על Run, ואז בחר חלבון ירוק פלואורסצנטי משופר עם CMV שהועבר היטב. כוון את מתח ה-FITC כך שיכלול גם תאים אוטופלואורסצנטיים ותאי פלואורסציה בגרף SSC-A מול FITC-A.

צור פוליגון כדי לאתר את אוכלוסיית התאים הבריאה. פוליגון שני לשער להבחנה כפולה בגרף SSC-H לעומת SSC-A. צור שער פוליגונים להבחנה בין תאים פלואורסצייתיים לאלו שאינם פלואורסציה, תוך שימוש בשער מהתאים שלא עברו כהפניה כהפנס.

הקלטת דגימות אוטומטית במהירות של 60 מיקרוליטר לדקה עד שעברו 200 שניות או שהושג 10,000 אירועים. לאחר מכן ייצא את ערכי FITC הממוצעים כקובץ CSV ונתח את הנתונים. נקה את ציטומטר הזרימה על ידי בחירת אפשרות הניקוי היומי.

הדמיית פלואורסצנציה הראתה כי ביחס מסה של אחד לתשע הפעלת אור כחול גרמה לביטוי eGFP מקסימלי נמוך יותר לעומת יחס חמש לחמש, שגם הוא הראה דליפה מוגברת במצב החשוך. ציטומטריית זרימה הראתה כי מעל 95% מהאירועים הסגורים ב-P1 היו סינגלטים בכל התנאים. ולתאים שלא עברו טרנספקט היו פחות מ-0.1% אוכלוסייה חיובית ל-eGFP.

בקרה של CMV-eGFP היו כ-99% תאים חיוביים ל-eGFP, בעוד שתאי 2pLACE שעברו טרנספקט הראו כ-57%. התאים שעברו טרנספקט CMV-eGFP הראו ביטוי חזק של eGFP בתנאי אור וחושך, בעוד שתאים שלא עברו טרנספקט לא הראו פלואורסצנציה נראית לעין. הוא גם אישר טרנספקציה מוצלחת של 2pLACE והפעלת ביטוי eGFP תחת אור כחול עם ביטוי נמוך יותר מ-CMVeGFP. נצפה עלייה פי שלושה בביטוי eGFP בדגימות 2pLACE המופעלות על ידי אור בהשוואה לתנאים חשוכים.

אחוז התאים החיוביים ל-eGFP בדגימות שעברו 2pLACE היה כ-60%. יחס מסה של שלושה לשבע יצר את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת והטווח הדינמי הגבוהים ביותר. פרוטוקול זה מאפשר הערכת תפוקה גבוהה של דגימות ושכפול טכני באמצעות ה-optoPlate לתכנות תנאי אור ותדרי פולסים משתנים.