September 12th, 2025
מחקר זה מציג שיטת הדמיה תלת מימדית המשתמשת ברקמות מעי שלמות ומיקרוסקופיה מרובת פוטונים כדי לכמת ריר מופרש, המאפשר ניתוח נפחי מדויק והדמיה של דינמיקת ריר בתגובה לגירויים כמו קרבמוילכולין כלוריד.
המחקר שלנו מתמקד במנגנוני הזרקת מיקרוביאלים עם רקמות ריריות, תוך הדגשת התפקיד המרכזי של הריר בוויסות אינטראקציות אלו. כימות ריר דו-ממדי מסורתי מפספס פרטים מרחביים ונפחיים. הפרוטוקול שלנו מאפשר ניתוח תלת-ממדי מדויק, החושף שינויים מבניים ופיזוריים על ידי התערבויות מולקולריות שנשכחו בשיטות קיימות.
פרוטוקול זה משלב הדמיית הורמונים עם כימות תלת-ממדי, ומספק מדידות חזקות וניתנות לשחזור של ארכיטקטורת ריר המעי המתאימות לתנאים ניסיוניים מגוונים והתערבויות מולקולריות העולות על ההערכה הדו-ממדית המקובלת. כדי להתחיל, הניחו עכבר מורדם בן שישה עד שמונה שבועות על כרית חימום, כדי לשמור על טמפרטורת גופו. חטא את פני עור העכבר באלכוהול, ובצע חתך בבטן התחתונה השמאלית כדי לחשוף את הצקום תוך שמירה על הרדמה.
עכשיו, זהה את האיליאום או המעי הגס הפרוקסימלי. הניחו את לולאת המעי על גזה סטרילית. שטוף עם PBS סטרילי ואבטח את שני הקצוות עם קליפסים עורקיים ליצירת לולאה סגורה באורך שלושה סנטימטרים.
בהרדמה, יש להזריק לא יותר מ-200 מיקרוליטר של תגובת PBS סטרילית או קרבמומילכולין כלוריד ללולאת המעי הקשורות. לאחר 30 דקות של טיפול, קצרו את לולאת המעי מהחיה שהושמדה. באמצעות מלקחיים, החזק את לולאת המעי ושוטף בעדינות ב-PBS סטרילי.
חתכו את לולאת המעי לאורך, עם חלק קטן שלא חתוך, ושוטפים שוב את הרקמה ב-PBS סטרילי. שטחו את הרקמה בצלחת של שישה סנטימטרים ופתחו את החלק שנותר. השתמש בקטעי חוט נחושת כדי לעגן אותו לבסיס האגרוז.
עכשיו, הוסיפו 10 מיליליטר של תמיסת פרפורמלדהיד 4% לצלחת כדי לקבע את הרקמה למשך 12 עד 24 שעות. לאחר הדגירה, יש להסיר את תמיסת הפרפורמלדהיד ולשטוף את הרקמה לפחות שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר שאריות פאראפורמלדהיד. לאחר מכן, טבלו את הרקמה ב-10 מיליליטר של בופר חסימה הכולל PBS בתוספת 0.4% Triton X-100 ו-3% BSA, ומאוחסנים בארבע מעלות צלזיוס למשך 12 עד 24 שעות.
הסר את בופר החסימה. צבעו את הרקמה בתמיסת צבע המכילה נבט חיטה, אגלוטינין ופאלואידין. ברקמות המעי הדק והמעי הגס שטופלו ב-PBS, ריר חיובי ל-WGA היה ממוקם בעיקר בתאי גביע על פני האפיתל האפיתליאליים.
לאחר טיפול בקרבמואילכולין כלוריד, כמות הריר החיובי ל-WGA במעי העיכול עלתה באופן ניכר הן במעי הדק והן במעי הגס, אך הריר התפזר לסירוגין במקום ליצור שכבה רציפה. נפח הריר החיובי ל-WGA הקשור לתאי הגביע ירד משמעותית לאחר טיפול בקרבמואילכולין כלוריד הן במעי הדק והן במעי הגס, מה שמעיד על הפרשת פעילה. כל נפחי ריר תאי הגביע ברקמות שטופלו ב-PBS היו מתחת ל-1,000 מיקרומטר מעוקב.
פריטים חיוביים ל-WGA בנפח מעל 1,000 מיקרומטר מעוקב סווגו כריחה מופרשת בלומן. טיפול בקרבמואילכולין כלוריד הגדיל את הנפח הכולל של הריר המופרש בכ-5 עד 20 פעמים הן ברקמות המעי הדק והן ברקמות המעי הגס.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
המחקר הנוכחי מציג פרוטוקול חדשני להדמיה תלת-ממדית של ריר מעיים באמצעות רקמות שלמות ומיקרוסקופיה רב-פוטונית. הוא מאפשר ניתוח נפחי מדויק והדמיה של דינמיקת הריר בתגובה לגירויים שונים.
Accurate three-dimensional quantification of intestinal mucus addresses a critical gap in discovery-stage gastrointestinal research by enabling absolute volumetric and spatial analysis of mucus secretion. This capability enhances predictive confidence in evaluating mucosal barrier function and the impact of molecular interventions, supporting risk-adjusted decisions in early target validation and mechanistic de-risking. The protocol's reproducibility and quantitative outputs position it as a foundational tool for pipeline advancement in mucosal biology and immunology portfolios.
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, quantitative readouts, and mechanistic de-risking in gastrointestinal research workflows.