גירוי של תאי אנדותל בכלי הדם באמצעות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנוכחות ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה

מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות מעורבות במגוון מחלות, כולל מחלות לב וכלי דם. עם זאת, ההשפעות הסינרגטיות של היווצרות NET וליפופרוטאינים על תאי כלי הדם נותרו לא ברורות. תוך שימוש בפרוטוקול זה, ניתוח מכניסטי נמשך עד היום כיצד נגרמות תגובות דלקתיות בתאי אנדותל אבי העורקים האנושיים המטופלים במלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות וליפופרוטאין בצפיפות נמוכה.

הוכחנו כי ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה פועל כמדכא היווצרות NET. זה מקודם על ידי ליפופרוטאין מחומצן בצפיפות נמוכה, פוספוליפידים מחומצנים וליזופוספוליפידים. כדי להתחיל, צנטריפוגה של 45 עד 50 מיליליטר של דם מלא אנושי המתקבלת בצינור הפרין ב -700 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

הפחיתו לאט את מהירות הצנטריפוגה לאחר הסיבוב, ואז אספו את השכבה העליונה המכילה את שבר הפלזמה. צנטריפוגה את שבר הפלזמה פעמיים ב-700 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את תאי הדם לחלוטין, תוך שמירה על אותה הגדרת האטה. לאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסת EDTA של 250 מילי-מולרית לכל מיליליטר פלזמה כדי למנוע חמצון מתכת דו-ערכי בתיווך יונים של ליפופרוטאינים.

הכניסו 2.7 מיליליטר מהפלזמה לתוך צינור האולטרה-צנטריפוגה. כיסוי עם 900 מיקרוליטר PBS המכיל 250 מיקרו-מולרי EDTA. ואז אולטרה-צנטריפוגה את הצינור ב 600, 000 גרם למשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, השליכו 900 מיקרוליטר מהשכבה העליונה כדי לחסל את שבר הכילומיקרון. הוסף 900 מיקרוליטר של PBS המכיל EDTA על גבי הפלזמה הנותרת ואולטרה-צנטריפוגה ב-600, 000 גרם למשך 2.5 שעות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו 900 מיקרוליטר מהשכבה העליונה כדי לחסל את חלק הליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד.

לאחר מכן הוסף לפלזמה 540 מיקרוליטר של 0.5 גרם לתמיסת אשלגן ברומיד מיליליטר כדי להתאים את הצפיפות ל-1.063. מערבבים את התוכן בעדינות בעזרת פיפטה ואולטרה-צנטריפוגה בחום של 600, 000 גרם למשך 2.5 שעות בארבע מעלות צלזיוס. אסוף 540 מיקרוליטר מהשכבה העליונה המכילה ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה.

העבירו את השבר שנאסף לקרום דיאליזה ועשו דיאליזה כנגד שני ליטרים של PBS המכילים EDTA בארבע מעלות צלזיוס בחושך כדי לחסל אשלגן ברומיד. הוסף 152 מיקרוליטר של 0.01% פוליליזין, או 0.1% תמיסת ג'לטין לכל באר של צלחת של 12 בארות ודגר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לפחות. לאחר מכן הוציאו את התמיסה מהבארות, שטפו פעם אחת עם 200 מיקרוליטר מים סטריליים, ואפשרו לבארות להתייבש לחלוטין בטמפרטורת החדר.

אחסן את הצלחת המוכנה בטמפרטורת החדר עד לשימוש נוסף. הכן את הצלחות המצופות ג'לטין לפי אותו הליך שהודגם עבור פוליליזין. תרבית פעמיים כפול עשר בחזקת שישה תאי HL60 לכל 10 מיליליטר במדיום RPMI-1640, בתוספת שתי חומצה רטינואית מיקרו-מולרית all-trans.

לאחר ארבעה ימים של דגירה עם חומצה רטינואית טראנס, אסוף את תאי HL60. צנטריפוגה את התאים שנאספו ב-220 גרם למשך ארבע דקות ב-18 עד 22 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט ואז שטפו את התאים בנפח שווה של מדיום RPMI-1640 ללא סרום.

צנטריפוגה את התאים השטופים שוב ב-220 גרם למשך ארבע דקות ב-18 עד 22 מעלות צלזיוס והשעו מחדש את התאים במדיום RPMI-1640 נטול סרום. לאחר התאמת ריכוז התאים לשניים כפול עשר בחזקת שישה תאים למיליליטר, זרע 0.5 מיליליטר מהתרחיף לכל באר של צלחת בת 12 בארות מצופה מראש בפוליליזין. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום RPMI-1640 ללא סרום עם או בלי 300 ננו-מולרי פורבול 12-מיריסטט 13-אצטט או PMA.

תרבית התאים למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסר את המדיום מהבארות. שטפו את התאים פעם אחת במדיום RPMI-1640 נטול סרום והחליפו אותו ב-RPMI-1640 ללא סרום המכיל אפס או 20 מיקרוגרם למיליליטר של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה.

המשיכו לתרבת את התאים במשך שעתיים. אוספים את מדיום התרבות מכל באר לתוך צינור וצנטריפוגה בטמפרטורה של 700 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 18 עד 22 מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת סלולרית. לצורך גירוי, השג את תרבית תאי האנדותל של אבי העורקים האנושי והחלף את המדיום המושקע ב-0.5 מיליליטר של מדיום תרבית טרי, ודגר על התאים למשך 30 דקות.

לבסוף, הוסף 167 מיקרוליטר של מדיום התרבות שנאסף מתאים דמויי נויטרופילים המכילים מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות ו-LDL לצלחות תאי אנדותל אבי העורקים האנושי. גירוי של תאי אנדותל אבי העורקים האנושיים עם מלכודות חוץ-תאיות נויטרופיליות הוביל לשינויים מורפולוגיים תלויי מינון מצורה דמוית אבן לצורה מוארכת. שינויים מורפולוגיים בתאי אנדותל אבי העורקים האנושיים שופרו כאשר הם מגורים עם מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות המושרות על ידי LDL, עם התארכות נראית לעין כבר כשש שעות.