פלטפורמת הדמיה נטולת עדשות הניתנת לפריסה בשטח לניתוח מהיר ללא תוויות של הפעלת תאי הרג טבעיים

המטרה שלנו היא להעריך במהירות את תפקוד מערכת החיסון על ידי כימות הפעלת תאי NK בזמן אמת, באמצעות הדמיה ללא תוויות וללא עדשות כדי לשפר את הניטור החיסוני. הראינו כי מדד החיסון המולד, או I3, מבחין באופן אמין בין פעילות תאי NK של תורמים בריאים ומדוכאי חיסון ומתאם חזק עם הציטוקינים וסמני ציטומטריית הזרימה. מבחני תאי ה-NK הקיימים דורשים תוויות, מכשירים מגושמים וזמני דגירה ארוכים.

פלטפורמת ה-LSIT שלנו ממלאת את הפער הזה על ידי מתן אפשרות ליצירת פרופילים מהירה, משתלמת וללא תוויות באמצעות אופטו-אלקטרוניקה פשוטה. פלטפורמת ה-LSIT נטולת התוויות שלנו מבדילה את הפעלת תאי NK ברמת תא בודד תוך 30 שניות באמצעות פרמטרים של צל, ומבטלת את הצורך בצביעה ובזרימה ציטומטרית יקרה. אנו נרחיב את LSIT כדי לנטר את הפעלת תאי T ו-B ולשלב אלגוריתמים של למידה עמוקה לסיווג תפוקה גבוהה של מצבי תאי חיסון שונים.

כדי להתחיל, הוציאו מהמקרר את הערכות לבידוד תאי הרג טבעי, או NK, ואפשרו להן להגיע לטמפרטורת החדר, בין 15 ל-28 מעלות צלזיוס. הכן את הציוד הנדרש על ידי הצבת מפריד מגנטי, פיפטות עם קצות סטריליות, והגדר חממה או בלוק חימום ל -37 מעלות צלזיוס. בעזרת פיפטה, הוסף 0.5 מיליליטר דם מלא לצינור התגובה הירוק המכיל את קוקטייל הנוגדנים.

ערבבו בעדינות את התכולה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה של הצינור חמש עד שש פעמים. לאחר מכן, דגרו את הצינור למשך חמש דקות. העבירו את כל תכולת הצינור בעל המכסה הירוק לתוך צינור ההפרדה האדום באמצעות פיפטה, וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג הצינור חמש עד שש פעמים.

הנח את הצינור האדום על המפריד המגנטי ודגר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. תוך שמירה על המגנט במקומו, השתמש בפיפטה כדי להעביר כ-1.5 מיליליטר של הסופרנטנט לתוך צינור ההפרדה הסגול השני. ערבבו בעדינות את התכולה על ידי פיפטינג של השפופרת חמש עד שש פעמים.

כעת, הנח את הצינור הסגול על המפריד המגנטי ודגר למשך 10 דקות. בזמן שהמגנט עדיין במקומו, העבירו כ-1 מיליליטר של הסופרנטנט לתוך צינור התאוששות עם מכסה אפור באמצעות פיפטה, וערבבו בזהירות את התוכן על ידי פיפטינג של הצינור. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מתלה תאי ההרג הטבעי המבודד לתוך צינור הרכב ועוד 100 מיקרוליטר לתוך קוקטייל ממריץ ההפעלה, או ASC.

מערבבים בעדינות את תכולת שני הצינורות באמצעות מערבל מערבולת כדי להבטיח פיזור אחיד. דגרו את הצינורות בבלוק החימום או בחממה על 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. הפעל את פלטפורמת LSIT.

הפעל את תוכנת לכידת LSIT. היכנס על ידי הזנת המזהה והסיסמה שלך, ולאחר מכן בחר כיול כדי להתחיל במצב כיול. לחצו על כפתור הפתיחה במסך המגע או השתמשו בכפתור דלת ההזזה הפיזי כדי לפתוח את המגירה.

כאשר המגירה נפתחת, הסר את שקופית הכיול ואחסן אותה. כעת, לחץ על Set Background כדי לכייל את העוצמה האופטית. החזר את שקופית הכיול למגירה וסגור את המגירה.

לאחר מכן, לחץ על התחל כיול כדי להשלים את התהליך. הסר שקופית בדיקה מהשקית שלה. סמן אותו עם הנתונים לדוגמה לפני הנחתו על משטח נקי וישר.

פיפטה 10 מיקרוליטר של דגימת הרכב לתעלות A ו-B, ולאחר מכן פיפטה 10 מיקרוליטר מהדגימה המגורה ASC לתעלות C ו-D.כעת, לחץ על פתח כדי להוציא את המגירה. הסר את שקופית הכיול והנח אותה בקופסת אחסון. הכנס את שקופית הבדיקה המוכנה למגירה ולחץ על סגור כדי לאבטח אותה.

חזור לתפריט הראשי ובחר את פעילות תא NK ובדיקה מהמסך הראשי. הזן את מזהה הדגימה או סרוק את הברקוד כדי לטעון את הפרופיל לדוגמה. לאחר מכן, לחץ על לכידה כדי להתחיל בהקלטת תמונה.

לאחר לכידת התמונה, לחץ על ניתוח כדי להתחיל בעיבוד. סקור את אחוז הפעילות של תאי NK ואת ספירת התאים המוצגים על המסך. הורד את התוצאות לכונן USB או הדפס אותן באמצעות תפריט מסך המגע.

בחר ספירת תאים ובדיקה בממשק הראשי של LSIT. טען 10 מיקרוליטר מהדגימה החדשה על תעלת שקופית בדיקה טרייה באמצעות פיפטה. הכנס את השקופית למגירה.

סגור את המגירה באמצעות מסך המגע או הלחצן והזן את מזהה הדגימה במערכת. הזינו את גורם הדילול במסך המגע, אם רלוונטי, ולחצו על ספירה כדי להתחיל בכימות התאים. הצג את התוצאות המוצגות כתאים למיקרוליטר על המסך.

לאחר הניתוח, פתח את המגירה על ידי לחיצה על כפתור הפתיחה או החלפת המתג הפיזי. הסר את השקופית המשומשת מהמגירה בעזרת ידיים עטויות כפפות. לבסוף, הכנס את מגלשת הכיול בחזרה למגירה כדי להגן על החיישן וסגור את המגירה באמצעות מסך המגע או מתג ההחלפה הפיזי.

פלטפורמת LSIT עם תוכנה משולבת העריכה כמותית את הפעלת תאי NK על ידי השוואת ערכי CSP של תאי בקרה מופעלים ולא מגורים. הוא סיפק לדוח החסינות טבלה סטטיסטית מסוכמת. גירוי ASC גרם לשינויים מורפולוגיים ברורים בתאי NK, כולל גודל מוגדל ומורכבות ציטופלזמית, כפי שניתן לראות בציטוספינים מוכתמים Hema 3 לאחר 30 דקות ושעתיים.

תמונות צל הראו כי לתאים מגורים ASC היו דפוסי עקיפה מורכבים יותר בהשוואה לבקרות רכב, כאשר פרמטרים שחולצו מצביעים על מרחק שיא לשיא מוגבר, גרעיניות ציטופלזמית ופרמטר צל משולב. ערכי פרמטר צל משולבים אפשרו סיווג ברור בין תורמים בריאים לחולי סרטן, עם חפיפה מינימלית בהתפלגות תאים בודדים של תאי NK פעילים ולא פעילים. תורמים בריאים הראו ערכי מדד חסינות מולדת גבוהים משמעותית מאשר חולי סרטן לאחר גירוי ASC.