הערכת ההשפעה של גורמי SASP על התפשטות תאים סרטניים באמצעות ניתוח השוואתי של שלוש מתודולוגיות שונות

תאי סרטן זקנים מפרישים גורמים כאלה המשפיעים על תאים שכנים. אנו מציגים שלושה מודלים חוץ-גופיים לחקר השפעות הפרקרין והניגוד המונעים על ידי SASP על התרבות תאי HeLa, ניטור התנגדות בזמן אמת ודימות תאים חיים המאפשרים ניתוח דינמי, קינטי ומורפולוגי, החושף השפעות פרקריניות מזדקנות ומיקרו-סביבתיות שמעבר לבדיקות קצה מסורתיות. כדי להתחיל, הפעל את מערכת ניתוח התאים בזמן אמת לפני זריעת התאים.

השיק את תוכנת RTCA גרסה 2.0. לחצו על כפתור X הערות והזינו את פרטי הניסוי. לחץ על כפתור התזמון והוסף שני שלבים להקליט רקע ולניטור התפשטות תאים כל 15 דקות במשך 72 שעות.

בחר את הצעד הראשון ולחץ על הפעל. הוסף ידנית 50 מיקרוליטר של מדיום מלא לכל באר בתצוגת הפלטת האלקטרונית. לאחר מכן, שטפו גם את תאי ה-HeLa הזקנים וגם את תאי הלא זקנה עם חמישה מיליליטר של PBS סטרילי ומחומם מראש.

לאחר השאיבה, הוסיפו מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין מחומם מראש ודגרו. נטרלו את הטריפסין עם חמישה מיליליטר של DMEM מלא עם תוספת אנטיביוטיקה. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 500 גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

לאחר השלכת הסופרנאנט, החזירו את כדורי התא בחמישה מיליליטר של DMEM מלא עם תוספת אנטיביוטיקה. כעת, זרעו תאי HeLa שאינם מזדקנים לכל באר של לוויין e-plate אחד ב-100 מיקרוליטר של DMEM מלא עם תוספת אנטיביוטיקה. הניחו את תצוגת הפלטת האלקטרונית בעריסה של מערכת ניתוח התאים בזמן אמת כדי לאפשר לתאים להתחבר לפני הלוח באינקובטור.

בחר את השלב השני ולחץ על Play כדי להתחיל מדידת התנגדות. תאי הזרעים בפלטת ה-e-plate מכילים 60 מיקרוליטר של DMEM מלא בתוספי אנטיביוטיקה תחת שלוש מערכות ניסוי שונות. שמרו על הכנסת פלטה אלקטרונית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם 5% פחמן דו-חמצני למשך שש שעות לצורך חיבור.

לחץ על עצירה לאחר שש שעות של זריעת תאים, ואז שאפו בעדינות את מדיום התרבית מכל באר בתצוגת ה-e-plate כדי להסיר את הסרום ותאים לא דביקים לזה. בארות שטיפה פעמיים עם PBS מחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הוסיפו 140 מיקרוליטר DMEM ללא סרום לכל באר בתצוגת ה-e-plate.

הסר את המדיום. שטיפו בארות של תוספת פלטה אלקטרונית עם PBS, ואז מוסיפים 60 מיקרוליטר DMEM ללא סרום. כעת, מקם את הכנסת ה-e-plate בתצוגת ה-e-plate.

לחץ בעדינות עד שהאינסרט נזרע במלואו בבאר. הכנס את הלוח המשולב למערכת ניתוח התאים בזמן אמת. לחץ על Play כדי לחדש ניטור בזמן אמת של ערכי אינדקס התאים במרווחי זמן של 15 דקות באמצעות התוכנה.

נרמול ערכי אינדקס התאים בנקודת הזמן שבה תצוגת ה-e-plate והכניסת הלוח האלקטרוני משולבים ומוכנסים למערכת ניתוח התאים בזמן אמת. לאחר מכן, לחצו על כפתור ניתוח הנתונים כדי לחשב את קצב ההתרבות והכמות באמצעות נתוני מדד התאים והשיפוע המקסימליים שהתקבלו ממערכת ניתוח תאים בזמן אמת. לאחר מכן, נתחו את הנתונים באמצעות תוכנית סטטיסטית מתאימה.

שאפו את מדיום הגידול משני הלוחות בעלי שישה בארות המכילים את תאי הללה הזקנים והלא מזדקנים. שטוף את התאים פעמיים עם PBS מחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להסיר שאריות סרום ושאריות תאים. הוסיפו שני מיליליטרים של מדיום DMEM ללא סרום עם תוספת אנטיביוטיקה לכל באר, ואז דגרו את התאים באינקובטור לחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך 48 שעות.

אסוף את המדיה המעובדת מכל באר לצינורות סטריליים בארון בטיחות למינרי. צנטריפוגה אספה את המדיה המותנית ב-1000 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס להסרת שאריות תאים, ולאחר מכן בצנטריפוגה ב-10,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל את הסופרנאנט המובהק. לאחר מכן, צנטריפוגה את המדיה המעובדת באמצעות יחידות סינון אולטרה-צנטריפוגליות בנפח שני מיליליטרים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ב-3000 גרם כדי לרכז אותה ל-400 מיקרוליטר.

דילל את הריכוז המתקבל עם מדיום טרי ללא סרום להכנת מדיום מרוכז מרוכז של 1x, 2x ו-3x בצינורות סטריליים בתא בטיחות למינרי. כאשר התאים מחוברים, שאפו בעדינות את מדיום התרבית מכל באר של תצוגת e-plate כדי להסיר את הסרום ותאים לא דביקים ולשטוף עם PBS. לאחר מכן, פיפטה של 200 מיקרוליטר חיממה מראש את המדיום המותנה שנאסף בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לכל קבוצה.

הכנס את תצוגת ה-e-plate למערכת ניתוח התאים בזמן אמת ולחץ על Play כדי לחדש ניטור בזמן אמת של ערכי אינדקס התאים במרווחי זמן של 15 דקות למשך 48 שעות. תאי זריעה על מיקרוסלייד תחת שלוש מערכות ניסוי ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה עם 5% פחמן דו-חמצני. לאחר שמונה שעות של הצמדה, שטפו את התאים פעמיים עם PBS מחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

הוסיפו 200 מיקרוליטר של Dulbecco's Modified Eagle's Medium ללא סרום לכל באר. הפעל את בקר הטמפרטורה 2002-2 והגדר אותו ל-37 מעלות צלזיוס. הפעל את ה-CO2-Controller 2000 והגדר אותו ל-5% פחמן דו-חמצני.

הפעל את מקור האור הפלואורסצנטי. הנח את המחסנית על תא הדגירה בראש הבמה. הפעל את התוכנה במחשב.

בחר את המטרה של 20x. הוסיפו את ערוץ הניגודיות הפאזה ואת ערוץ FITC הפלואורסצנצי. באמצעות בקר הבמה, סמן את המיקומים לכל מיקום.

הגדר את מרווח הזמן ל-30 דקות ואת משך הרכישה ל-48 שעות, ואז התחיל ברכישה. ספירת תאים ירוקים עם חלבון פלואורסצנטי חיובי בשתי נקודות הזמן וחישבה את אחוז העלייה לניתוח. טיפול בדוקסורוביצין גרם באופן משמעותי להזדקנות תאית בתאי HeLa.

כימות תאי SA-beta-gal-חיוביים הראה אחוז גבוה משמעותית בקבוצת הטיפול בדוקסורוביצין בהשוואה לקבוצת הביקורת. בגישה הראשונה, תאי HeLa שאינם זקנים שתרבו יחד עם תאי HeLa מזדקנים הראו קצב רבייה וקיבולת גבוהים משמעותית בהשוואה לתאים שגודלו יחד עם תאי HeLa שאינם מזדקנים. מדיה מותנית שמקורם בתאי HeLa מזדקנים בריכוזים של 2x ו-3x הגדילו משמעותית את קצב השתרבות והקיבולת של תאי HeLa שאינם מזדקנים בהשוואה למדיה מותאמת של תאים לא מזדקנים.

בגישה השלישית, לאחר 48 שעות של קו-קולטורציה, תאי HeLa חיוביים ל-GFP הראו עלייה משמעותית גדולה יותר בהתרבות כאשר תאי HeLa מזדקנים במשותף בהשוואה לבני ביקורת לא סנסנטיביים או רק עם GFP.