חשיפת בקרה אלקטרומכנית של הומאוסטזיס רקמות באמצעות מכשיר מיקרופלואידית דו-שכבתי
19 בספטמבר 2025
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור מכשיר מיקרופלואידית דו-שכבתי ייחודי לחקר הוויסות האלקטרומכני של הומאוסטזיס של רקמת האפיתל. המכשיר מפעיל זרמים חשמליים פיזיולוגיים סטטיים בניצב למישור הרקמה, ומשפיע על הידבקות תאים, התפשטות ושחול. הדמיית תאים חיים ומדידות מתח מכני חושפות מנגנונים של תהליכים אלה.
אנו מיישמים שדות חשמליים מבוקרים כדי לחקור כיצד רקמות מגיבות לרמזים חשמליים, תוך התמקדות באופן שבו זרמים או שדות מווסתים את הידבקות התאים, התפשטות ושחול, ומשפיעים על הומאוסטזיס של רקמות. גילינו שכיוון הזרמים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית מכתיב את מצבי הרקמה. שדה אפיקלי לבסיסי גרם לפנוטיפ שגשוג, בעוד ששדה בסיסי עד אפיקלי מקדם שחול תאים, ומאפשר אפנון של צפיפות התא הכוללת.
בעוד שמחקרים ביו-אלקטריים כמותיים התמקדו זה מכבר בהגירה באמצעות גרביטקסיס, הומאוסטזיס של רקמות נותר בלתי נגיש. המערכת שלנו מאפשרת כעת חקירה ישירה של האופן שבו קרטונים פיזיולוגיים מווסתים את ארגון ותחזוקת הרקמות. הפרוטוקול שלנו משלב מיקרופלואידיקה, גירוי חשמלי של רקמות, מיקרוסקופ מבנה וכוח והדמיה חיה כדי לחקור בקרה אלקטרומכנית של הומאוסטזיס רקמות.
עבודתנו חשפה כללי צימוד אלקטרומכניים מרכזיים. בעזרת כלים חדשים, אנו יכולים כעת לחקור כיצד דפוסים ביו-חשמליים טבעיים מופיעים ומווסתים רקמות ואם אנו יכולים לשלוט בהתנהגות רקמות מורכבת על ידי כוונון הרמזים האלקטרומכניים הללו. כדי להתחיל, הניחו שכבה נקייה תבנית אחת של פולידימתילסילוקסן, או תבנית PDMS, עם הפנים כלפי מעלה על מכסה כלי פלסטיק נקי והוסיפו לאט לאט 500 מיקרוליטר של דבק נוזלי אולטרה סגול הניתן לריפוי על התבנית.
בעזרת מרית יש להרטיב בזהירות את כל המבנים הבולטים ולהסיר את כל בועות האוויר שנוצרו בתהליך ההרטבה. לחץ בעדינות על פתק כיסוי על תבנית ה-PDMS והשתמש במגב מעבדה כדי להסיר עודפי דבק אולטרה סגול הניתן לריפוי וודא שהצד העליון של החלקת הכיסוי יישאר נקי ושטוח. לרפא את המבנה באופן חלקי תחת אור אולטרה סגול מואר באופן אחיד באורך גל שבין 363 ל-370 ננומטר.
נגב את כל הסימנים באמצעות 75% אתנול. לאחר מכן, החזיקו את המבנה בחוזקה על משטח ישר וקילפו לאט את תבנית ה-PDMS מהשכבה הראשונה. לאחר מכן, הניחו שכבה נקייה של שתי תבנית PDMS עם הפנים כלפי מטה על לוח PDMS שטוח בעובי של יותר מ-2.5 מילימטרים.
הקש בעדינות על תכונות התבנית מלמעלה בעזרת פינצטה. שימו לב לממשק שמתחת לתכונות לכהות או ניגודיות אופטית, המאשרת מגע תקין. כעת, מלאו את החלל בין תבנית ה-PDMS ללוח בדבק אולטרה סגול נוזלי הניתן לריפוי על ידי פעולה נימית.
לרפא חלקית את המבנה באור אולטרה סגול למשך 10 שניות, כפי שהודגם קודם לכן. השתמש בפינצטה מרופדת רכה כדי לקלף בעדינות את שכבת הדבק המרוכבת הניתנת לריפוי אולטרה סגול ותבנית PDMS מלוח ה-PDMS. במידת הצורך, חתוך את הקצוות העודפים של שכבת הדבק המתרפאת בעזרת מספריים חדים.
לאחר מכן, הניחו שכבה אחת המחוברת לכיסוי זכוכית מלבני על משטח ישר. יישר את השכבה השנייה, שעדיין מחוברת לתבנית ה-PDMS שלה, עם שכבה ראשונה ולחץ את שתי השכבות יחד בחוזקה עד שיופיעו צללים מתחת לתכונות. רפאו את המבנה המיושר באור אולטרה סגול למשך 10 שניות כדי לחבר שכבות אחת ושתיים לשבב מיקרופלואידית דו-שכבתי, ולאחר מכן קלפו בעדינות את תבנית ה-PDMS מהשבב המודבק.
פיפטה מיד 10 מיקרוליטר של תמיסת מבשר ג'ל פוליאקרילאמיד על אמצע אזור הרקמה ישירות מעל החריץ בשכבה השנייה. לחץ בעדינות על פתק כיסוי זכוכית עגול בקוטר 10 מילימטרים על הטיפה ליצירת ג'ל שטוח. התבונן בתמיסת הג'ל זורמת לשכבה הראשונה דרך החריץ ועצור בשורת עמודי המחסום.
רפא מיד את השבב המיקרופלואידי המורכב באור אולטרה סגול למשך חמש דקות. לאחר מכן, השאר את השבב ללא הפרעה למשך כשעה כדי לאפשר לג'ל הפוליאקרילאמיד להתמצק במלואו. לאחר מכן, דגרו את השבב המיקרופלואידי במאגר HEPES 0.1 מולארי ב-pH 7.4 למשך שעה אחת לפחות כדי להרטיב את הג'ל ולהפחית את ההידבקות בין הג'ל להחלקת הכיסוי.
לאחר מכן, השתמש בעדינות בפינצטה חדה כדי להסיר את החלקת הכיסוי ממשטח הג'ל. הנח מחסנית פוליקרבונט בדרגה רפואית על משטח ישר כשהחלק התחתון פונה כלפי מעלה ויישר שבב מיובש עם הפנים כלפי מטה עם המחסנית. דבק פיפטה UV הניתן לריפוי בחריצים שבין השבב למחסנית, ממלא אותם באמצעות אפקט נימי ומרפא אותו באור UV.
עקר את המכשירים המיקרופלואידיים המיוצרים על ידי הצבתם תחת אור אולטרה סגול בטמפרטורה של 200 עד 280 ננומטר בתוך ארון בטיחות ביולוגית. הכן את הנפח הנדרש של 50 מיקרוגרם למיליליטר קולגן תמיסת עבודה אחת ב-1X DPBS על קרח. על קרח, הכינו את תמיסת העבודה של Sulfo-SANPAH על ידי דילול שני מיקרוליטרים של תמיסת מלאי Sulfo-SANPAH, שהומסו בעבר בדימתיל סולפוקסיד נטול מים ב-80 מיקרוליטר של מאגר HEPES קר 0.1 מולרי ב-pH 7.4 המאוחסן בארבע מעלות צלזיוס.
טפחו את שולי ג'ל הפוליאקרילאמיד במגבוני מעבדה כדי לייבש אותו בתוך המכשיר. פיפטה 80 מיקרוליטר של תמיסת עבודה Sulfo-SANPAH על משטח הג'ל, מה שמבטיח טבילה מלאה, והנח את השבב תחת אור אולטרה סגול למשך חמש דקות כדי להפעיל את ה-Sulfo-SANPAH. שטפו את הג'ל שלוש פעמים עם מאגר HEPES קר 0.1 מולארי ב-pH 7.4.
חזור על הטיפול ב-Sulfo-SANPAH על ידי פיפטינג של 80 מיקרוליטר של תמיסת עבודה SS על הג'ל והקרנתו באור אולטרה סגול למשך חמש דקות. הפעם, שטפו את הג'ל שלוש פעמים עם 1X DPBS קר. לבסוף, פיפטה 100 מיקרוליטר קולגן תמיסה אחת על ג'ל הפוליאקרילאמיד, מה שמבטיח כיסוי מלא, והשאירו אותו למשך שעה.
שטפו את הקולגן הלא מחובר עם 1X DPBS שלוש פעמים, ולאחר מכן השאירו את הג'ל שקוע ב-1X DPBS עד לשימוש נוסף. חבר התקנים לתוספות באמצעות ברגים. לאחר מכן, אבטח עד ארבעה מכללי תוחב התקן למחזיק המיועד להרכבה על מיקרוסקופtagה.
הוסף שני מיליליטר של מדיום תרבית לכל באר ראשית של המכשירים ודרך תעלות פינוי הפסולת כדי לשטוף ולהחליף את ה-1X DPBS. לאחר מכן, הכנס את אלקטרודות הפלטינה לתוך הצינור המכיל 45 מיליליטר של מדיום, וודא שהן שקועות במלואן במדיום. משוך את מדיום התרבות דרך צינור טיגון בעזרת מזרק והצמד אותו בחוזקה.
חבר קצה אחד של הצינור המלא במדיום לתא האלקטרודות ואת הקצה השני למכשיר. כעת, הכינו תרחיף תאים על ידי ביצוע המלצות הטריפסיניזציה או הכנת תרחיף התאים וזרעו 0.1 מיליון תאים לבאר הראשית. התקן את ההתקנה על המיקרוסקופ עם תאי האלקטרודות בצדדים וחבר את מד המקור לתא האלקטרודות.
השתמש בשלושה מכשירים בעלי התנגדות ערוצים זהה. הקצה אחד כקבוצת ביקורת. החל זרם אפיקלי על בזאלי על המכשיר השני וזרם בזאלי על ההתקן השלישי.
מקור אות חשמלי במצב מהדק זרם וספק זרם כולל של 20 מיקרו-אמפר. בחר עדשת אובייקטיבית 20X להדמיית רקמות שלמות עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. לבסוף, בחר ערוץ 561 עבור ערוצי פלואורסצנטיות אדומים וערוצי שדה בהיר.
בחר מרווח זמן של שעה אחת במהלך הדמיה ארוכת טווח. גירוי חשמלי הופעל בניצב לתאים כדי לשבש את הפוטנציאל הטרנס-אפיתל לחקור את תפקידו בהתנהגות הרקמות בכיווני זרם שונים. תחת הדמיית ניגודיות פאזה, זרמים אפיקליים לבסיסיים, או ATB, גרמו לצמתים של תאים להתבהר תוך 10 דקות מהיישום, בעוד שבקרה ותנאי BTA בסיסיים לאפיקליים, הראו ניגודיות נמוכה ומשטחים אפיקליים שטוחים.
זרמי ATB יצרו קמירות כלפי חוץ על פני התא האפיקלי. עיוות ג'ל היה תלוי מאוד בכיוון הזרם. זרמי ATB משכו את הג'ל כלפי מעלה, בעוד שזרמי BTA דחסו את הג'ל כלפי מטה.
עוצמת ה-E-cadherin הצומתית עלתה תחת זרמי BTA, אך ירדה משמעותית תחת זרמי ATB בהשוואה לבקרה. עוצמת האקטין הצומת ירדה תחת זרמי ATB, אך לא עלתה באופן משמעותי תחת זרמי BTA ביחס לבקרה. זרמי ATB הפעילו שחול תאים חיים רב-תאיים על פני החד-שכבה, בעוד שזרמי BTA שמרו על מבנה חד-שכבתי, בדומה לבקרה.
ההטרוגניות המרחבית בהתפלגות התאים הייתה גבוהה משמעותית תחת זרמי ATB, אך נותרה נמוכה ואחידה בתנאי BTA ובקרה. שיעורי התפשטות התאים גדלו תחת גירוי ATB, עם שיעורי חלוקה גבוהים יותר לאורך זמן. לעומת זאת, זרמי BTA גרמו ליותר אירועי מוות של תאים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול למכשיר מיקרופלואידי דו-שכבתי שנועד לחקור את הוויסות האלקטרו-מכני של הומיאוסטזיס ברקמה אפיתליאלית. באמצעות הפעלת זרמים חשמליים פיזיולוגיים סטטיים, המכשיר משפיע על היצמדות תאים, שגשוג והדחקה (extrusion), ובכך חושף מנגנונים קריטיים באמצעות דימוי של תאים חיים ומדידות של מאמץ מכני.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מיקרופלואידיקה
רקע
- הבנת ההומאוסטזיס של רקמות היא קריטית לביולוגיה התפתחותית ולרפואה רגנרטיבית.
- הוכח כי שדות חשמליים משפיעים על התנהגויות תאיות, אך תפקידם בארגון רקמות פחות מובן.
- מחקרים קודמים התמקדו בנדידה, מה שהותיר פער בידע בנוגע לתחזוקת רקמות.
- מחקר זה שואף לגשר על פער זה באמצעות טכנולוגיה מיקרופלואידית חדשנית.
מטרת המחקר
- לבחון כיצד שדות חשמליים מווסתים היצמדות תאים, פרוליפרציה ואקסטרוזיה ברקמות אפיתליאליות.
- לחקור את ההשפעות של כיוון הזרם החשמלי על מצבי הרקמה.
- לפתח מערכת המאפשרת תצפית ישירה על רמזים פיזיולוגיים בארגון הרקמה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור של התקן מיקרופלואידי דו-שכבתי.
- הפעלת שדות חשמליים מבוקרים על רקמות אפיתליאליות.
- דימוי תאים חיים למעקב אחר תגובות תאיות.
- מדידות מאמץ מכני להערכת שלמות הרקמה.
תוצאות עיקריות
- שדות חשמליים משפיעים באופן משמעותי על היצמדות ות proliferation של תאים.
- שדות חשמליים הפועלים מהצד האפייקלי לבזאלי משרים פנוטיפ פרוליפרטיבי.
- שדות הפועלים מהצד הבזאלי לאפייקלי מקדמים אקסטרוזיה של תאים, ובכך משפיעים על צפיפות התאים הכללית.
- המערכת מאפשרת תובנות חדשות לגבי הבקרה האלקטרו-מכנית של הומיאוסטזיס ברקמה.
מסקנות
- ההתקן המיקרופלואידי שפותח הוא כלי רב עוצמה לחקר תגובות של רקמות לרמזים חשמליים.
- הממצאים משפרים את ההבנה כיצד ניתן להשתמש בשדות חשמליים בהנדסת רקמות.
- מחקר זה פותח נתיבים למחקרים עתידיים על ארגון ותחזוקה של רקמות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מרכזית
בקרה אלקטרומכנית של הומאוסטזיס רקמתי מהווה נקודת מפנה קריטית להבנה ולשליטה בהתנהגות של רקמה אפיתליאלית במחקרי גילוי מוקדמים ומחקרים תרגומיים. התקן מיקרופלואידי דו-שכבתי זה מאפשר בחינה מדויקת של האופן שבו זרמים חשמליים פיזיולוגיים מווסתים פרוליפרציה, אקסטרוזיה ואדהזיה של תאים, ובכך משפיע ישירות על רמת הוודאות החזוית בפורטפוליו של הנדסת רקמות ומכננביולוגיה. הפלטפורמה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית ובתיקוף תפקודי של מטרות עבור אסטרטגיות של מודולציה ביו-חשמלית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של השערות ביו-אלקטריות במערכות ברמת הרקמה.
- מבהיר את המסלולים האלקטרו-מכניים המשפיעים על גורל התא וארגון הרקמה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור הכיוון הנוכחי למצבי רקמה מובחנים.
- מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות המעורבות בבקרה חשמלית של הומיאוסטזיס.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת פלטפורמה הניתנת לשחזור ולהרחבה להערכה כמותית של שגשוג תאים ואקסטרוזיה תחת תנאים חשמליים מוגדרים.
- מסטנדרטת את המדידה של עוצמת חלבונים בצומת התאים ומעץ מכני בתגובה לשדות חשמליים.
- מאפשרת שילוב של דימוי בתכנים גבוהים (high-content imaging) ומיקרוסקופיית כוחות לסריקה פנוטיפית חסונה.
- מכינה מודלים מאוששים של רקמות להערכה של תרכובות בשלבים הבאים, המכוונות למסלולים אלקטרו-מכניים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה תגובות רקמה in vitro לרמזים ביו-אלקטריים פיזיולוגיים הרלוונטיים למחלה ולרגנרציה.
- תומכת ברצף מהשלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני על ידי מידול תוצאות ברמת הרקמה של מודולציה חשמלית.
- מספקת נתונים מותאמי סיכון לקידום התערבויות ביו-אלקטריות בתהליכי פיתוח של הנדסת רקמות.
- מאפשרת חקירה של ביומרקרים תרגומיים הקשורים למצבים אלקטרו-מכניים של רקמות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פלטפורמה מיקרופלואידית זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים, פיתוח בדיקות ומחקר תרגומי, על ידי מתן אפשרות למחקרים כמותיים ומבוקרים של ויסות רקמה אלקטרומכני.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי האופן שבו זרמים חשמליים מניעים מעברים במצב הרקמה והחלטות לגבי גורל התא.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים הניתנים לשחזור עבור פרולפרציה של תאים, אקסטרוזיה ודינמיקה של חלבוני חיבור.
- אנליטיקה: משלב דימוי תאים חיים ומיקרוסקופיית כוח לצורך ניתוח השוואתי של הפרעות חשמליות.
- מחקר טרנסלציונלי: ממדל תגובות רקמה רלוונטיות למחלה תחת מודולציה ביו-חשמלית להבטחת רציפות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת להסתגלות ולשימוש חוזר עבור יישומים מגוונים במכנוביולוגיה והנדסת רקמות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות אלקטרו-מכניות ובמודולציה של מצב הרקמה.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בדיקות אלקטרו-מכניות לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין צוותי מו"פ.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקה (go/no-go) של אסטרטגיות להתערבות ביו-אלקטרית ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם-סיכון של תוכניות להנדסת רקמות ומכנו-ביולוגיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרופלואידיקה, בדימות תאים חיים ובמיקרוסקופיית כוח.
- מחייב גישה לתשתית של גירוי חשמלי מדויק ובדימות כמותית.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של ייצור ההתקנים ושל פרוטוקולי הבדיקה.
- ניתן להתאמה למודלים אפיתליאליים שונים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור סוגי רקמות שונים.
- המגבלות כוללות את הצורך בבקרה קפדנית על כיוון הזרם ועוצמתו כדי להבטיח רלוונטיות פיזיולוגית.
