מוטגנזה מבוססת CRISPR-Cas9 בנמטודה אנטומופתוגנית Steinernema hermaphroditum ושימור קווי מוטנטים

אנו עובדים על הגנטיקה של סימביוזה חיידקי הנמטודה, שיש לה יישומים חקלאיים. הכלים הגנטיים בחיידקי Xenorhabdus מפותחים היטב, אך הגנטיקה של EPN נשארת מוגבלת, והיא מתבססת בעיקר על RNAi ובדיקות EMS. כדי להתחיל, יש להשיג לוחות אגר של נמטודות עם זרעים ב-Xenorhabdus griffiniae ו-Comamonas aquaticus.

אספו נמטודות Steinernema hermaphroditum על לוחות NGM המוכנים המכילות Xenorhabdus griffiniae. דגרו אותם בטמפרטורה של 25 עד 28 מעלות צלזיוס לצמיחה מיטבית. בלילה שלפני הזרקת מיקרו, קטף הרמפרודיטים בשלב J3 על לוחות אגר טריים של NGM עם זריעה של Xenorhabdus griffiniae.

ביום ההזרקה המיקרו, בחרו הרמפרודיטים צעירים להזרקה. חלצו את רצף הגן היעד מגנום הייחוס של Steinernema hermaphroditum באמצעות BlastP. בחר אקסון קודד מוקדם, רצוי האקסון הראשון, והזן את הרצף ל-CRISPRscan באמצעות הגדרות ברירת מחדל ליצירת RNA של CRISPR מועמדים.

תכה ב-RNA של CRISPR המועמד המוביל מול הגנום של Steinernema hermaphroditum כדי לוודא שאין התאמות לא מדויקות. יש לאחסן את ה-RNA של ה-CRISPR שנבחרו ואת RNA ה-CRISPR האוניברסלי המפעיל טרנס-אקטיבי ב-100 מיקרומולר כל אחד בבופר דופלקס בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. המיס 2% אגרוז במים באמצעות מיקרוגל.

העבר 50 מיקרוליטר של האגרוז המומס לכוס כיסוי. תכסה מיד את זה בכוס כיסוי שנייה. לאחר זמן ייבוש של 20 דקות, הסר את הכיסוי העליון, ואז תייג את הצד הקדמי של משטח האגרוז.

אחסן את כריות האגרוז בטמפרטורת החדר לשימוש ארוך טווח למשך חודשים עד שנים. כדי להכין את המחטים להזרקה, משוך נימי קוורץ על מושך חוטי לייזר ואחסן את המחטים בקופסת אחסון פיפטות. הכינו דופלקסים של RNA מדריך חדש על ידי ערבוב ה-crRNA הנבחרים ו-RNA CRISPR אוניברסלי שמפעילים טרנס-אקטיבציה ביחס אחד לאחד.

דגרו את הצינור בטמפרטורה של 94 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, ואז קררו לטמפרטורת החדר לדופלקסים אניליים. הרכיבו את תערובת ההזרקה על ידי שילוב Cas9, אשלגן כלוריד וה-gRNA דופלקסים ודגרו את התערובת. הפעל את צינור ה-PCR שלוש פעמים לערבוב, ואז סובב לרגע 10 עד 15 שניות בצנטריפוגה קטנה.

לאחר המיקס הסופי, סובבו עד דקה אחת כדי לאסוף את התוכן. לאחר מכן, השתמש בקצה מיקרולודר כדי להעמיס אחד עד שניים מיקרוליטר של תערובת הזרקה לתוך המחט. התקן את המחט על המחזיק, שבור את הקצה על ידי גרירת סרט דו-צדדי מתחת לשמן הלוקרבון.

ולבדוק את גודל הפתח באמצעות פונקציית הניקיון של המיקרואינג'קטור. הנח טיפה קטנה של שמן הלוקרבון על משטח האגרוז של 2%. באמצעות מיקרוסקופ ניתוח וחוט פלטינה רך, תרים הרמפרודיט צעיר.

שטוף אותו בבופר M9 כדי להסיר את החיידקים. העבר את הנמטודה למשטח אגרוז, והנח אותה בטיפת שמן הלוקרבון. השתמש בחוט הפלטינה הרך כדי להבריש בעדינות את הנמטודה עד שהיא תקועה.

התקן את הרפוד על שלב המיקרו-הזריקה. אתר זרוע אחת בגונדלית וחדור אותה עם המחט. השתמשו בפונקציה הנקייה של המזרק כדי לספק את תערובת ההזרקה בקצב של 99 פאונד לאינץ' רבוע עד שהזרימה הגונדלית נראית, מה שמאשר את הגישה לראגנט לסינציטיום.

אם זה נגיש, הזזיר את השלב והזריק לזרוע הגונדלית השנייה באותה מידה. מיד לאחר ההזרקה, החזירו את החיה שהוזרקה במיקרוליטר עד שניים של בופר M9 על משטח האגרוזה. השתמשו בחוט פלטינה דק כדי להוציא את התולעת המוזרקת מהפד, ואז שטפו שמן עם בופר M9, ושחזרו אותו על צלחת ה-NGM שזרעה ב-Comamonas aquatica.

דגרו את צלחת ההתאוששות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. למחרת, בודדו כל נמטודת P0 שהוזרקה על פלטות NGM בודדות שהוזרעו ב-Xenorhabdus griffiniae. שני RNA של CRISPR תוכננו כדי לכוון להומולוג של Steinernema hermaphroditum של UNC-22 באתרים PAM שפורסמו בעבר.

ניתוח של נמטודות שנחשפו לניקוטין הראה הבדלים ברורים בתנועה בין מוטנטים של UNC-22 לנמטודות מסוג פראי. גנוטיפינג של צאצאים מתכווצים באמצעות PCR הראה רצועות חלשות רבות באתר היעד עבור פאם 3 ופאם 5. הריצוף אישר אירועי החדרה ומחיקה באתר UNC-22 המיועד אליו.

המעבדה שלי הרחיבה את עבודת הפוסט-דוקטורט שלי בגנטיקה של EPN. CRISPR זמין כעת בשלושה מיני Steinernema. בפרוטוקול זה הקמנו טכניקה יעילה ליצירת מוטנטים יציבים ותורשתיים באמצעות עריכת גנים CRISPR-Cas9.

עם עריכת גנים יציבה של CRISPR-Cas9, ניתן לנתח את המנגנונים המולקולריים שמאחורי הסימביוזה בין שטיינרנמה לקסנורהבדוס.