Name: מוטגנזה מבוססת CRISPR-Cas9 בנמטודה אנטומופתוגנית Steinernema hermaphroditum ושימור קווי מוטנטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: למדו הנדסת גנום CRISPR-Cas9 בנמטודה Steinernema hermaphroditum ליצירת מוטנטים וניתוח פונקציית גנים. השיטה מאפשרת חקר מנגנוני סימביוזה ושליטה ביולוגית במזיקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Stock, S., Blair, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes+and+their+bacterial+symbionts%3A+The+inside+out+of+a+mutualistic+association%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association.</a> Symbiosis. 46, 65-75 (2008).</li>
<li>Murfin, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode-bacterium+symbioses--cooperation+and+conflict+revealed+in+the+%26%2334%3Bomics%26%2334%3B+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bull%22%5BJournal%5D)">Nematode-bacterium symbioses--cooperation and conflict revealed in the &#34;omics&#34; age.</a> Biological Bull. 223 (1), 85-102 (2012).</li>
<li>Dillman, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entomopathogenic+nematode+by+any+other+name%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">An entomopathogenic nematode by any other name.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002527(2012).</li>
<li>Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+is+a+self-fertilizing+hermaphrodite+and+a+genetically+tractable+system+for+the+study+of+parasitic+and+mutualistic+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis.</a> Genetics. 220 (1), iyab170(2022).</li>
<li>Sergeant, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+typing%2C+and+insecticidal+activity+of+Xenorhabdus+isolates+from+entomopathogenic+nematodes+in+United+Kingdom+soil+and+characterization+of+the+xpt+toxin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification, typing, and insecticidal activity of Xenorhabdus isolates from entomopathogenic nematodes in United Kingdom soil and characterization of the xpt toxin loci.</a> Appl Environ Microbiol. 72 (9), 5895-5907 (2006).</li>
<li>Walsh, K. T., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+microbial+populations+in+Steinernema+%28Steinernematidae%2C+Nematoda%29+infected+Galleria+mellonella+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interaction of microbial populations in Steinernema (Steinernematidae, Nematoda) infected Galleria mellonella larvae.</a> J Invertebr Pathol. 83 (2), 118-126 (2003).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+The+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: The two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (8), 634-646 (2007).</li>
<li>Flores-Lara, Y., Renneckar, D., Forst, S., Goodrich-Blair, H., Stock, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+nematode+age+and+culture+conditions+on+morphological+and+physiological+parameters+in+the+bacterial+vesicle+of+Steinernema+carpocapsae+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Influence of nematode age and culture conditions on morphological and physiological parameters in the bacterial vesicle of Steinernema carpocapsae (Nematoda: Steinernematidae).</a> J Invertebr Pathol. 95 (2), 110-118 (2007).</li>
<li>Cao, M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ready+or+Not%3A+Microbial+adaptive+responses+in+dynamic+symbiosis+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Ready or Not: Microbial adaptive responses in dynamic symbiosis environments.</a> J Bacteriol. 199 (15), e00883-e00916 (2017).</li>
<li>Lacey, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+pathogens+as+biological+control+agents%3A+Back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Insect pathogens as biological control agents: Back to the future.</a> J Invertebr Pathol. 132 (C), 1-41 (2015).</li>
<li>Campos-Herrera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspecific+virulence+of+entomopathogenic+nematodes+against+the+pests+Frankliniella+occidentalis+%28Thysanoptera%3A+Thripidae%29+and+Tuta+absoluta+%28Lepidoptera%3A+Gelechiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nematol%22%5BJournal%5D)">Intraspecific virulence of entomopathogenic nematodes against the pests Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae) and Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> J Nematol. 53 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Rill, A., Zhao, L., Bode, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+toolbox+for+Photorhabdus+and+Xenorhabdus%3A+pSEVA+based+heterologous+expression+systems+and+CRISPR%2FCpf1+based+genome+editing+for+rapid+natural+product+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Genetic toolbox for Photorhabdus and Xenorhabdus: pSEVA based heterologous expression systems and CRISPR/Cpf1 based genome editing for rapid natural product profiling.</a> Microb Cell Fact. 23 (1), 98(2024).</li>
<li>Ratnappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+gene+knockdown+by+microinjection+in+the+model+entomopathogenic+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated gene knockdown by microinjection in the model entomopathogenic nematode Heterorhabditis bacteriophora.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 160(2016).</li>
<li>Cao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+editing+in+Steinernema+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome editing in Steinernema entomopathogenic nematodes.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+genetically+manipulating+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culturing and genetically manipulating entomopathogenic nematodes.</a> J Vis Exp. (181), e63885(2022).</li>
<li>Stock, S. P., Griffin, C. T., Chaerani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+characterisation+of+Steinernema+hermaphroditum+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%2C+an+entomopathogenic+nematode+from+Indonesia%2C+and+its+phylogenetic+relationships+with+other+members+of+the+genus%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular characterisation of Steinernema hermaphroditum n. sp. (Nematoda: Steinernematidae), an entomopathogenic nematode from Indonesia, and its phylogenetic relationships with other members of the genus.</a> Nematology. 6 (3), 401-412 (2004).</li>
<li>Bhat, A. H., Chaubey, A. K., Shokoohi, E., William Mashela, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+Steinernema+hermaphroditum+%28Nematoda%2C+Rhabditida%29%2C+from+West+Uttar+Pradesh%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Study of Steinernema hermaphroditum (Nematoda, Rhabditida), from West Uttar Pradesh, India.</a> Acta Parasitol. 64 (4), 720-737 (2019).</li>
<li>Schwarz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomes+of+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+and+its+associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Genomes of the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum and its associated bacteria.</a> bioRxiv. , (2025).</li>
<li>Haglund, K., Nezis, I. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+stable+intercellular+bridges+formed+by+incomplete+cytokinesis+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of stable intercellular bridges formed by incomplete cytokinesis during development.</a> Commun Integr Biol. 4 (1), 1-9 (2011).</li>
<li>Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+for+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100748(2021).</li>
<li>Gang, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+a+human-parasitic+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode.</a> PLoS Pathog. 13 (10), e1006675(2017).</li>
<li>Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-based+transfection+enhances+RNAi+and+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+non-model+nematode+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems.</a> Sci Rep. 9 (1), 483(2019).</li>
<li>Culp, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+nematode+Caenorhabditis+briggsae+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the nematode Caenorhabditis briggsae using the CRISPR/Cas9 system.</a> Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa003(2020).</li>
<li>Hellekes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+gene+editing+in+non-model+nematode+Panagrolaimus+sp.+PS1159%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genome+Ed%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated gene editing in non-model nematode Panagrolaimus sp. PS1159.</a> Front Genome Ed. 5, 1078359(2023).</li>
<li>Patel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+stable+transgenic+lines+in+the+human-infective+nematode+Strongyloides+stercoralis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">The generation of stable transgenic lines in the human-infective nematode Strongyloides stercoralis.</a> G3 (Bethesda). 14 (8), jkae122(2024).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+Designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: Designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nat Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genome+editing+strategy+to+generate+putative+null+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9.</a> G3 (Bethesda). 8 (11), 3607-3616 (2018).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+Edits+from+Sanger+Trace+Data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data.</a> CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>McMullen, J. G. 2nd, Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+rearing+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae+and+Heterorhabditidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae).</a> J Vis Exp. (91), e52096(2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+co-CRISPR+strategy+for+efficient+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).</li>
<li>Ciche, T. A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+RNAi+in+Heterorhabditis+bacteriophora%3A+A+nematode+insect+parasite+and+host+for+insect+pathogenic+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: A nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts.</a> BMC Dev Biol. 7 (1), 101(2007).</li>
<li>Du, X., McManus, D. P., French, J. D., Jones, M. K., You, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9%3A+A+new+tool+for+the+study+and+control+of+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9: A new tool for the study and control of helminth parasites.</a> Bioessays. 43 (1), e2000185(2021).</li>
<li>Quinzo, M. J., Perteguer, M. J., Brindley, P. J., Loukas, A., Sotillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+parasitic+helminths%3A+A+brief+history+and+prospects+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in parasitic helminths: A brief history and prospects for the future.</a> Parasit Vectors. 15 (1), 110(2022).</li>
<li>Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Peraza, J., Raymundo, K. L. T., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+a+peroxidase+gene+controlling+body+size+in+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of a peroxidase gene controlling body size in the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum.</a> Genetics. 226 (2), (2024).</li>
<li>Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+genome+editing+with+short+single-stranded+and+long%2C+partially+single-stranded+DNA+donors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>אגר (80-100 רשת)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP26411</td><td>משמש גם בלוחות LB Pyruvate</td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>16500500</td><td>משמש גם בגנוטיפינג</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>IDT</td><td>1072532</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>מחטי בורוסיליקט</td><td>מכשיר הדיוק העולמי</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>כלוריד סידן (CaCl2)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול &nbsp;</td><td>VWR</td><td>433</td><td>5 מ"ג/מ"ל באתנול</td></tr><tr><td>Comamonas aquatica (DA1877)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי למשטח אגרוז</td><td>מעבדות מחקר מוח</td><td>#4860-1D</td><td>48 x 60 מ"מ עובי no1</td></tr><tr><td>CRISPRScan</td><td></td><td></td><td>https://www.crisprscan.org/</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>472301</td><td>0.5 מ'</td></tr><tr><td>DNA Clean and Concentrator-5&nbsp;</td><td>מחקר זימו</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 4x Microinjector עם סט ראש אחיזה, מחזיק מחט בגודל 4 0</td><td>אפנדורף/קליבר</td><td>5253000017</td><td></td></tr><tr><td>זחלי גלריה מלונלה מדרגה 5</td><td>GrubCo</td><td></td><td>https://www.grubco.com/index.cfm</td></tr><tr><td>מערכת הדמיית ג'ל</td><td>Azure400</td><td>AZI400-01</td><td></td></tr><tr><td>צבע טעינת ג'ל</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>B72</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין (2%)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>ביוטיום</td><td>#41003</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים לגנוטיפ: אוליגו DNA, 25 ננומול</td><td>IDT</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>גיבקו בקטו פפטון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>גיבקו בקטו טריפטון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>DF0123-17-3</td><td>משמש גם בלוחות Dark LB, LB Pyruvate &nbsp;</td></tr><tr><td>תמצית שמרי גיבקו בקטו</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>DF0127-17-9</td><td>משמש גם בלוחות Dark LB, LB Pyruvate &nbsp;</td></tr><tr><td>סט ראש לאחיזה, מחזיק מחט בגודל 1 בגודל 4</td><td>קליבר</td><td>EPE-5196083008</td><td>(בשילוב עם מחט בורוסיליקט 1B120F-4)</td></tr><tr><td>שמן הלוקרבון 700</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>מפרש תולעת חוט פלטינה קשה לתחזוקה יומיומית</td><td>טריטק ריסרץ'</td><td>PT-9901</td><td></td></tr><tr><td>הסקת עריכות CRISPR (ICE)</td><td>סינתגו</td><td>לא זמין</td><td>תוכנה המשמשת לניתוח רצפי סנגר לזיהוי אינדל</td></tr><tr><td>KCl</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>מושך מחט לייזר P-2000</td><td>סאטר</td><td>P-2000G</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט (MgSO4)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M7506</td><td>ל-M9 buffer, משמש גם ב-NGM</td></tr><tr><td>קצה מיקרולודר 2x96ST</td><td>קליבר</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>מתאם הרכבה למיקרומניפולטור עבור Zeiss Axio Observer ו-Axiovert 200</td><td>טריטק ריסרץ'</td><td>NZ-19-2</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>טריטק</td><td>SMT1</td><td></td></tr><tr><td>ניקוטין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>N3876</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>בופר דופלקס ללא נוקלאז</td><td>IDT</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq MasterMix</td><td>NEB</td><td>M0486</td><td></td></tr><tr><td>קופסת אחסון פיפטה</td><td>סאטר אינסטרומנטס</td><td>BX10</td><td></td></tr><tr><td>כלוריד אשלגן (KCl)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>793590</td><td></td></tr><tr><td>פוספט אשלגן, די-בסיסי (K2HPO4)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P3786</td><td>KOH עבור NGM</td></tr><tr><td>פוספט אשלגן, מונובסיסי (KH2PO4)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P5655</td><td>ל-M9 buffer, משמש גם ב-NGM</td></tr><tr><td>פרוטאנאז K</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>מחטי קוורץ</td><td>סאטר אינסטרומנטס</td><td>QF100-70-10</td><td></td></tr><tr><td>S. hermaphroditium גנום</td><td>NCBI</td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/</td></tr><tr><td>sh-unc-22 אלטרנטיבי CRISPR-Cas9 crRNA</td><td>IDT</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלוריד (NaCl)</td><td>VWR</td><td>SS0430</td><td>משמש גם בלוחות M9, Dark LB, LB Pyruvate</td></tr><tr><td>פוספט נתרן, די-בסיסי (Na2HPO4.7H20)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S9390</td><td>עבור בופר M9</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P2256</td><td>משמש גם בלוחות LB Pyruvate&nbsp;</td></tr><tr><td>מפרש תולעת חוט פלטינה רך להזרקה מיקרו</td><td>Surepure Chemetals</td><td>6824</td><td>פלטינה 90%, אירידיום 10% חוט סגסוגת, קוטר 0.002 אינץ' ואורך 5 רגל</td></tr><tr><td>מחזיק מחט סטנדרטי</td><td>טריטק ריסרץ'</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>Steinernema hermaphroditum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>לייקה</td><td>אינבטה 3</td><td></td></tr><tr><td>טרהלוז</td><td>קול-פרמר</td><td>EW-88195-99</td><td>0.08 מ'</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AM9855G</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>גיל 20</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>מתאם הרכבה למיקרומניפולטור אנכי</td><td>טריטק ריסרץ'</td><td>NR2</td><td></td></tr><tr><td>Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מוטגנזה מבוססת crispr-cas9 בנמטודה אנטומופתוגנית steinernema hermaphroditum ושימור קווי מוטנטים

CRISPR-Cas9-based Mutagenesis in the Entomopathogenic Nematode Steinernema hermaphroditum and the Maintenance of Mutant Lines

מוטגנזה מבוססת CRISPR-Cas9 בנמטודה אנטומופתוגנית Steinernema hermaphroditum ושימור קווי מוטנטים

Entomopathogenic nematodes (EPNs) in the genus Steinernema and Heterorhabditis maintain mutualistic interactions with Xenorhabdus and Photorhabdus ...

אנו עובדים על הגנטיקה של סימביוזה חיידקי הנמטודה, שיש לה יישומים חקלאיים. הכלים הגנטיים בחיידקי Xenorhabdus מפותחים היטב, אך הגנטיקה של EPN נשארת מוגבלת, והיא מתבססת בעיקר על RNAi ובדיקות EMS. כדי להתחיל, יש להשיג לוחות אגר של נמטודות עם זרעים ב-Xenorhabdus griffiniae ו-Comamonas aquaticus.אספו נמטודות Steinernema hermaphroditum על לוחות NGM המוכנים המכילות Xenorhabdus griffiniae. דגרו אותם בטמפרטורה של 25 עד 28 מעלות צלזיוס לצמיחה מיטבית. בלילה שלפני הזרקת מיקרו, קטף הרמפרודיטים בשלב J3 על לוחות אגר טריים של NGM עם זריעה של Xenorhabdus griffiniae.ביום ההזרקה המיקרו, בחרו הרמפרודיטים צעירים להזרקה. חלצו את רצף הגן היעד מגנום הייחוס של Steinernema hermaphroditum באמצעות BlastP. בחר אקסון קודד מוקדם, רצוי האקסון הראשון, והזן את הרצף ל-CRISPRscan באמצעות הגדרות ברירת מחדל ליצירת RNA של CRISPR מועמדים.תכה ב-RNA של CRISPR המועמד המוביל מול הגנום של Steinernema hermaphroditum כדי לוודא שאין התאמות לא מדויקות. יש לאחסן את ה-RNA של ה-CRISPR שנבחרו ואת RNA ה-CRISPR האוניברסלי המפעיל טרנס-אקטיבי ב-100 מיקרומולר כל אחד בבופר דופלקס בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. המיס 2% אגרוז במים באמצעות מיקרוגל.העבר 50 מיקרוליטר של האגרוז המומס לכוס כיסוי. תכסה מיד את זה בכוס כיסוי שנייה. לאחר זמן ייבוש של 20 דקות, הסר את הכיסוי העליון, ואז תייג את הצד הקדמי של משטח האגרוז.אחסן את כריות האגרוז בטמפרטורת החדר לשימוש ארוך טווח למשך חודשים עד שנים. כדי להכין את המחטים להזרקה, משוך נימי קוורץ על מושך חוטי לייזר ואחסן את המחטים בקופסת אחסון פיפטות. הכינו דופלקסים של RNA מדריך חדש על ידי ערבוב ה-crRNA הנבחרים ו-RNA CRISPR אוניברסלי שמפעילים טרנס-אקטיבציה ביחס אחד לאחד.דגרו את הצינור בטמפרטורה של 94 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, ואז קררו לטמפרטורת החדר לדופלקסים אניליים. הרכיבו את תערובת ההזרקה על ידי שילוב Cas9, אשלגן כלוריד וה-gRNA דופלקסים ודגרו את התערובת. הפעל את צינור ה-PCR שלוש פעמים לערבוב, ואז סובב לרגע 10 עד 15 שניות בצנטריפוגה קטנה.לאחר המיקס הסופי, סובבו עד דקה אחת כדי לאסוף את התוכן. לאחר מכן, השתמש בקצה מיקרולודר כדי להעמיס אחד עד שניים מיקרוליטר של תערובת הזרקה לתוך המחט. התקן את המחט על המחזיק, שבור את הקצה על ידי גרירת סרט דו-צדדי מתחת לשמן הלוקרבון.ולבדוק את גודל הפתח באמצעות פונקציית הניקיון של המיקרואינג'קטור. הנח טיפה קטנה של שמן הלוקרבון על משטח האגרוז של 2%. באמצעות מיקרוסקופ ניתוח וחוט פלטינה רך, תרים הרמפרודיט צעיר.שטוף אותו בבופר M9 כדי להסיר את החיידקים. העבר את הנמטודה למשטח אגרוז, והנח אותה בטיפת שמן הלוקרבון. השתמש בחוט הפלטינה הרך כדי להבריש בעדינות את הנמטודה עד שהיא תקועה.התקן את הרפוד על שלב המיקרו-הזריקה. אתר זרוע אחת בגונדלית וחדור אותה עם המחט. השתמשו בפונקציה הנקייה של המזרק כדי לספק את תערובת ההזרקה בקצב של 99 פאונד לאינץ' רבוע עד שהזרימה הגונדלית נראית, מה שמאשר את הגישה לראגנט לסינציטיום.אם זה נגיש, הזזיר את השלב והזריק לזרוע הגונדלית השנייה באותה מידה. מיד לאחר ההזרקה, החזירו את החיה שהוזרקה במיקרוליטר עד שניים של בופר M9 על משטח האגרוזה. השתמשו בחוט פלטינה דק כדי להוציא את התולעת המוזרקת מהפד, ואז שטפו שמן עם בופר M9, ושחזרו אותו על צלחת ה-NGM שזרעה ב-Comamonas aquatica.דגרו את צלחת ההתאוששות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. למחרת, בודדו כל נמטודת P0 שהוזרקה על פלטות NGM בודדות שהוזרעו ב-Xenorhabdus griffiniae. שני RNA של CRISPR תוכננו כדי לכוון להומולוג של Steinernema hermaphroditum של UNC-22 באתרים PAM שפורסמו בעבר.ניתוח של נמטודות שנחשפו לניקוטין הראה הבדלים ברורים בתנועה בין מוטנטים של UNC-22 לנמטודות מסוג פראי. גנוטיפינג של צאצאים מתכווצים באמצעות PCR הראה רצועות חלשות רבות באתר היעד עבור פאם 3 ופאם 5. הריצוף אישר אירועי החדרה ומחיקה באתר UNC-22 המיועד אליו.המעבדה שלי הרחיבה את עבודת הפוסט-דוקטורט שלי בגנטיקה של EPN. CRISPR זמין כעת בשלושה מיני Steinernema. בפרוטוקול זה הקמנו טכניקה יעילה ליצירת מוטנטים יציבים ותורשתיים באמצעות עריכת גנים CRISPR-Cas9.עם עריכת גנים יציבה של CRISPR-Cas9, ניתן לנתח את המנגנונים המולקולריים שמאחורי הסימביוזה בין שטיינרנמה לקסנורהבדוס.

crispr-cas9-based-mutagenesis-entomopathogenic-nematode-steinernema

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

הקרנת עבור מוטנטים עם מומים פנוטיפי היא שיטה פשוטה לזיהוי גנים פונקציה בתהליך ביולוגי נתון. במאמר זה אנו מתארים כיצד לשחרר את התרבות תולעים חיים...

מבוא מעבדה תולעת: מ תולעים culturing כדי mutagenesis

כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להחדיר נוקאאוט גן לתוך amastigote החילוץ של טריאנוסומה cruzi, באמצעות מערכת CRISPR/Cas9. פנוטיפ הצמיחה ניתן לעקוב גם על ידי ספירת התאים של התרבות האמסטימית axenic או על ידי התפשטות amastigote תאיים לאחר הפלישה התא מארח.

היכרות גנטית הסתרה ישירות לתוך השלב Amastigote של טריאנוסומה cruzi באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 משמש יותר ויותר כדי לאפיין את תפקוד הגנים באורגניזמים שאינם מודל. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור שורות נוק-אאוט של Culex pipiens, מהכנת תערובות הזרקה, להשגה והזרקה של עוברים יתושים, כמו גם כיצד לגדל, לחצות, מסך מוזרק יתושים וצאצאיהם עבור מוטציות הרצויות.

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

פרוטוקול זה מפרט את השלבים של CRISPR / Cas9 mutagenesis ממוקד זבובי חול: אוסף עוברים, הזרקה, גידול חרקים, זיהוי, כמו גם מבחר של מוטציות של עניין.

זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינג'קציה עבור CRISPR/Cas9 מוטגנזה

מאפיינים רבים של אאוסוציאליות חרקים נשענים על תקשורת בתוך המושבה וחלוקת עבודה. מניפולציה גנטית של גנים רגולטוריים מרכזיים בעוברי נמלים באמצעות מיקרו-הזרקה ומוטגנזה בתיווך קריספר מספקת תובנות על טבעה של התנהגות אלטרואיסטית בחרקים אאוסוציאליים.

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר עריכה חלקה של CRISPR/Cas9 של הגנום C. elegans באמצעות מתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים וסמן ה- DPY-10 המשותף CRISPR להקרנה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע מגוון של שינויים גנטיים C. elegans כולל הוספות, מחיקות, תחליפי גנים והחלפות קודון.

CRISPR/Cas9 עריכה של ג'ין C. elegans rbm-3.2 באמצעות סמן ההקרנה DPY-10 Co-CRISPR ומתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים.

מוצג כאן פרוטוקול של Helicoverpa armigera (Hübner) עובר microinjection וזיהוי מוטציה נוקאאוט שנוצר על ידי עריכת הגנום CRISPR / Cas9. חרקים מוטנטיים מאפשרים מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים ב- vivo.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

מחקר זה מספק הליך מותאם באופן שיטתי של בנייה מבוססת ריבונוקלאז CRISPR/Cas9 של מוטציות ארבה הומוזיגוטיות, כמו גם שיטה מפורטת לשימור בהקפאה והחייאת ביצי ארבה.

בניית מוטנטים הומוזיגוטיים של ארבה נודד בטכנולוגיית CRISPR/Cas9

נמטודות אנטומופתוגניות חיות בסימביוזה עם חיידקים ויחד הן מדביקות בהצלחה חרקים על ידי ערעור מערכת החיסון המולדת שלהן. כדי לקדם את המחקר על הבסיס הגנטי של זיהום נמטודות, מתוארות שיטות לשמירה ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות.

תרבות ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות

למדו הנדסת גנום CRISPR-Cas9 בנמטודה Steinernema hermaphroditum ליצירת מוטנטים וניתוח פונקציית גנים. השיטה מאפשרת חקר מנגנוני סימביוזה ושליטה ביולוגית במזיקים.

מוטגנזה מבוססת CRISPR-Cas9 בנמטודה אנטומופתוגנית Steinernema hermaphroditum ושימור קווי מוטנטים

גלה סרטונים נוספים