הדמיית סידן in vivo ו-ex-vivo של נוירון במעגל הריח בזחל Drosophila melanogaster בכוכב השלישי

פרוטוקול זה משתמש בדבק רקמות GLUture כדי לשפר את היכולת בהדמיית סידן in vivo ו-ex-vivo. זה מאפשר לחוקרים להבין את דינמיקת הסידן בתא עצב במעגל הריח בזחלי דרוזופילה של הכוכב השלישי. פשטות וחסכון בעלויות הם שני היתרונות העיקריים של טכניקה זו, מה שהופך את הניסויים לאמינים ונגישים יותר במחקר נוירופיזיולוגי.

הכינו שני תאי האכלה על ידי הנחת ריבוע קטן של ניגוב כימי בצלחות פטרי בשישה סנטימטרים. לתנאי רעב, הוסף 350 מיקרוליטר מים מזוקקים. לתנאים שאינם מורעבים, הוסף 350 מיקרוליטר של תמיסת סוכרוז מולרית 0.2.

העבירו מספר שווה של זחלים שטופים לכל תא האכלה. אפשר לזחלים להיזון מסוכרוז, מים לא מורעבים או מזוקקים, מורעבים, במשך שעתיים בטמפרטורת החדר על זכוכית כיסוי מיקרוסקופ בגודל 24 על 50 מילימטרים, בעובי 1.5 מילימטרים, צור באר, באמצעות ג'לי נפט המופץ ממזרק. יש להניח טיפה קטנה של דבק רקמות מקומי GLUture במרכז זכוכית הכיסוי.

מורחים את ה-GLUture באופן שווה לשכבה דקה ואחידה, באמצעות מוט זכוכית. העבירו בזהירות זחל בודד ל-GLUture באמצעות מברשת או חוט דק. לחץ בעדינות את הצד הגחוני של הזחלים על הדבק.

אפשר ל-GLUture להתייבש, וודא שהזחלים משותקים לחלוטין. לאחר שהזחלים משותקים, טבלו את הזחל ב-100 מיקרוליטר של מאגר הדמיה. הנח את זכוכית הכיסוי על מיקרוסקופ הפוך Leica DMi8, המחובר למודול סורק קונפוקלי של דיסק מסתובב Yokogawa CSU-W1, ומצלמת CCD להדמיית סידן.

הכן זכוכית כיסוי מיקרוסקופ עם GLUture להדמיית סידן, כמתואר בשלבים 3.2 עד 3.3. השלם את הנתיחה כפי שתוארה על ידי Ishimoto and Sano, 2018. בעזרת מיקרו פיפטה P-10, שאפו בזהירות את המוח המנותח עם חמישה מיקרוליטרים של תמיסת דיסקציה מצלחת הפטרי.

הוציאו לאט את המוח אל ה-GLUture. לפני שה-GLUture מתייבש, כוונו את המוח למצב גבי כלפי מעלה כאשר שתי אונות המוח פונות כלפי מטה וחוט הגחון הגבי כלפי מעלה. באמצעות מיקרו פיפטה P-200, העבירו 100 מיקרוליטר של מאגר הדמיית סידן על מוח הזחלים המשותק על זכוכית הכיסוי.

פתח את VisiView להדמיית סידן, באמצעות מיקרוסקופ מסתובב הפוך Leica DMi8. צלם תמונות באמצעות 10X/1.4 כל אובייקט עם מסננים, מעבר בין לייזר GFP ללייזר RFP. ערכי החשיפה נעים בין 100 ל-1000 אלפיות השנייה והרווח נקבע על 50% מערך החשיפה המתאים.

מקדם הצעת מחיר של שניים מוחל במהלך צילום התמונה. זהה את הנוירון המעניין על ידי חיפוש האות tdTomato עם לייזר RFP. לאחר זיהוי אזור העניין, עבור ללייזר GFP כדי ללכוד אותות GCaMP6f.

ודא שגם אותות tdTomato וגם GCaMP מדברים לפני צילום תמונות מחסנית של שני הערוצים. צלם שתי הקלטות נפרדות של סדרות זמן של אותות הצלחה של tdTomato ו-GCaMP6f בו-זמנית בקצב של 0.5 פריימים לשנייה, למשך שתי דקות בסך הכל. ייבא את ערימות האותות tdTomato ו-GCaMP6f ל-ImageJ.

כדי לזהות את אזור העניין הנכון, מזג את האותות tdTomato ו-GCaMP6f כדי לאשר את הקולוקליזציה. לאחר האימות, פצל את ערוצי tdTomato ו-GCaMP6f. ייבא את פקודות המאקרו המותאמות אישית המבוססות על החזר ROI ל-ImageJ.

בחר את מחסנית GCaMP6f ולחץ על Run לניתוח סידן. המאקרו מייצר תחילה הקרנות בעוצמה מקסימלית, מבצע תיקון תנועה, באמצעות תוסף stack reg ומחיל תיקון אקונומיקה. תיקון התנועה בוצע על ידי הגדרת אזור עניין מלבני רחב, כגון אונת המוח בכל פריים.

הקופסה המלבנית חייבת לכסות את כל ההחזר על ההשקעה בכל המסגרות כדי להבטיח תיקון תנועה מדויק, תוך שמירה על צורה מקומית, מרחבית והחזר ROI על פני כל המסגרות. כל החזר ROI, פקודות המאקרו שחושבו אחת, העוצמה על פני כל המסגרות, שתיים, הפרש התנודות הבסיסי, כגון ההפרש בין ערכי העוצמה המקסימלית והמינימלית במהלך 10 הפריימים הראשונים, ושלוש, שינוי עוצמת המסגרת המקסימלי למסגרת, החזר ההשקעה של דלתא F.ROIs המראים תנודות עוצמה של פחות מ-10 יחידות בוטלו. מערך הנתונים הסופי אורגן בארבע עמודות, אחת, זמן ומסגרות, שתיים, תנאי דגימה מורעבים או מוזנים, שלושה מזהה העתק, דגימות בודדות וארבע, עוצמה מנורמלת.

ערך הנורמה F השתנה מאפס לאחד. לבסוף, ניתוח נתונים והדמיה בוצעו ב-R, תוך שימוש בסקריפטים מותאמים אישית של R. החבילות הנדרשות, כולל ggplot2, dplyr ו-readr הותקנו ועודכנו לפני הפעלת הניתוח.

הפלט כלל מפות חום הממחישות את עוצמת הסידן המנורמלת עבור 30 הפריימים הראשונים, 60 הפריימים וכל המסגרות בהקלטת סדרת הזמן, ותרשימי קופסאות להצגת חציון העוצמות המנורמלות. המשמעות של עוצמת הסידן המנורמלת הוערכה באמצעות מבחן Mann-Whitney U. איור אחד הוא סכמטי עבור מערכי הדמיית סידן in vivo ו-ex-vivo.

דגימת זחל שלמה A, או דגימת מוח זחל B, הייתה מקובעת על שכבה דקה של GLUture בצבע כחול מלא, מפוזרת בתוך באר של ג'לי נפט, ועגולה על זכוכית כיסוי מיקרוסקופ. הדגימות הוטבלו במאגר הדמיית סידן, כחול בהיר, והונחו להדמיה על מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב הפוך. סדרות זמן של תמונות פלואורסצנטיות של סידן של הדגימות נלכדו.

סכמטי הוכן באמצעות BioRender. איור שני ממחיש הדמיה פלואורסצנטית של GCaMP6f. A, תמונות מפוצלות המציגות פלואורסצנטיות בערוץ 488 ננומטר, GCaMP6f וירוק, וערוץ 525 ננומטר, tdTomato באדום.

התמונה הממוזגת מוצגת בחלונית הימנית. B, דוגמה לעקבות פלואורסצנטיות גולמיות לאורך זמן עבור GCaMP6f בירוק ו-tdTomato באדום ב-LNs קיסטון. תנודות בקרינה GCaMP6f מצביעות על פעילות סידן בעוד שהאות היציב tdTomato משמש כבקרה לזיהוי LNs מפתח.

C, תמונות אות GCaMP6f מייצגות עבור פאנלים עליונים in-vivo והכנות לפאנל התחתון ex-vivo. דגימות שאינן מורעבות מוצגות משמאל, ודגימות מורעבות מוצגות מימין. איור 3 מתאר מדידות פלואורסצנטיות GCaMP6f.

A, הפאנל השמאלי העליון מציג מפת חום המציגה את הדינמיקה הזמנית הממוצעת של אותות סידן מיסודות אבן מפתח מזחלים לא מורעבים, N=5, וזחלים מורעבים, N=5, בזחלים שלמים בהכנה in-vivo. תרשים הקופסה בפאנל הימני העליון משווה את עוצמת אות הסידן המנורמל בין לא מורעב באפור, לבין רעב בדגימות לבנות בתכשיר in-vivo. מבחן Mann-Whitney U, P הוא פחות מ-0.001.

B, הפאנל השמאלי התחתון מציג מפת חום המציגה את הדינמיקה הממוצעת לפורטל של אותות סידן מ-Keystone LN מ-N=5 לא מורעב, ו-N=5 מורעב במוח המנותח של הכנה ex-vivo. תרשים הקופסה בפאנל הימני התחתון משווה את עוצמת אות הסידן המנורמל בין דגימות לא מורעבות, אפורות ומורעבות, לבנות, בתכשיר ex-vivo. מבחן Mann-Whitney U B הוא פחות מ-0.001.

כדי להדגים את גישת הדמיית הסידן של הזחלים שלנו, יישמנו אותה בהצלחה על תכשירים in vivo ו-ex-vivo של זחלי הדרוזופילה. בשני התכשירים, ראינו פעילות LN גבוהה יותר ודגימות מורעבות בהשוואה לדגימות שאינן מורעבות. פעילות אבן מפתח גבוהה יותר זו נצפתה בבירור במפות חום, המציגות ייצוגים זמניים של התגובות לאורך 60 שניות, ובתרשימי קופסאות המתארים ערכי עוצמת אות ממוצעים.

תוצאות אלה עולות בקנה אחד עם המחקרים האחרונים המדגימים פעילות גבוהה יותר של נוירוני ריח בבעלי חיים מורעבים. כפי שמודגם בסרטון זה, דבק רקמות GLUture מפחית משמעותית את חפצי התנועה הן בהגדרות in-vivo והן ב-ex-vivo. ניתן ליישם שיטה זו גם לחקר סוגים שונים של גירויים, למשל, יישום חיצוני של ריחות והיתוך פנימי של נוירומודולטורים.