הכנת מדגם למחקרי מטבולומיקה של ספקטרומטריית מסה של תא בודד: שטיפת תאים משולבת, מרווה, ייבוש ואחסון

פיתחנו פרוטוקולים לשימור שלמות המטבוליטים התאיים למחקרי ספקטרומטריית מסה של תא בודד. חקרנו כיצד תנאי כביסה, מרווה ואחסון משפיעים על מטבוליטים של תאים. שיטות חדשות להכנת דגימות וטכניקות ספקטרומטריית מסה פותחו לאחרונה כדי לקדם מחקרי מטבולומיקה של תא בודד כדי להבין טוב יותר את ההטרוגניות התאית ומנגנוני המחלה.

חוקרים צריכים להתגבר על מספר אתגרים מרכזיים, כולל כמות דגימה מוגבלת, רגישות גילוי מופחתת עקב מורכבות הדגימה ומטבוליטים משתנים עקב הכנת הדגימה וניתוחה. אנו מדגימים טכניקות הכנת דגימות מקיפות שיכולות לשמר מטבוליטים תאיים ושלמות התא עבור מחקרים מטבולומיים של ספקטרומטריית מסה של תא בודד. הפרוטוקולים שלנו יכולים להציע דרך פשוטה ויעילה להכנה, אחסון והובלה של דגימות למחקרים מטבולומיים של תא בודד תוך שימוש בטכניקות ספקטרומטריות מסה שונות.

כדי להתחיל, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה המכילה 5% פחמן דו חמצני. עקוב אחר מפגש התאים מדי יום והעביר אותם כאשר התרביות מגיעות למפגש של 80%. למעבר יש לשאוב את המדיום מהכלי ולשטוף פעם אחת עם חמישה מיליליטר PBS.

דגרו על התאים עם שני מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות כדי להקל על ניתוק התאים. נטרל את הטריפסין על ידי הוספת שמונה מיליליטר של מדיום שלם שמחמם מראש ופיפטה בעדינות כדי לפזר את התאים. העבירו מיליליטר אחד מהתרחיף לתשעה מיליליטר של מדיום טרי ושלם לספירת התאים.

כדי לזרוע את התאים, יש לדלל אותם לריכוז סופי של אחד כפול 10 בחזקת שישה תאים למיליליטר. הנח החלקות כיסוי זכוכית בודדות של 18 מילימטר לבארות של צלחת 12 בארות. הוסף שני מיליליטר של מדיום שלם ו -200 מיקרוליטר של תרחיף התאים לכל באר כדי להשיג פעמיים פי 10 בחזקת חמישה תאים לבאר.

דגרו על התאים למשך הלילה כדי לאפשר היצמדות. לשטיפת התאים, הוסף שני מיליליטר תמיסת אמוניום קרה לכל באר בצלחת 12 הבארות. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים סטריליים, הרם בעדינות כל תלוש כיסוי המכיל תאי הדבקה מהבאר שלו והנח אותו בקצרה למשך שתיים-שלוש שניות בבאר נפרדת מלאה מראש בשני מיליליטר של תמיסת פורמט אמוניום קרה של 0.9%.

מניחים כל תלוש כיסוי שטוף בפורמט אמוניום כשהתאים פונים כלפי מעלה לתוך צלחת פטרי בתוך מיכל נייר אלומיניום. שפכו לאט 10 עד 20 מיליליטר של חנקן נוזלי על החלקות הכיסוי כדי להבטיח כיסוי מלא. ומיד הטה את צלחת הפטרי בפינצטה כדי לשפוך את כל החנקן הנוזלי שנותר.

בעזרת כפפות קריוגניות ופינצטה מבודדת, הנח את צלחת הפטרי המכילה את מכסה צינת החנקן הנוזלי לתוך תא ריכוז הוואקום. עבד את הדגימות באמצעות הגדרות הוואקום הסטנדרטיות למשך חמש עד שבע דקות עד שהחנקן הנוזלי הנראה מתאדה והכיסוי מחליק יבש. ודא שהחלקות הכיסוי המיובשות אינן מכילות שאריות חנקן נוזלי או גבישי קרח.

לאחר מכן, עטפו את המיכל במגבת נייר והעבירו אותו למקפיא של 80 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר האחסון, העבירו את פתקי הכיסוי המכילים את צלחת הפטרי לייבוש בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. ודא שכפור מרוכז או מים על החלקות הכיסוי נעלמים לחלוטין לפני הסרתם מחומר הייבוש.

חלקו את הדגימות לשתי קבוצות והתייחסו אליהן כראוי. כעת, הרכיב את הגשושית הבודדת על שלב ה-XYZ והצמד אותה למניפולטור XYZ ממונע הממוקם מתחת למיקרוסקופ דיגיטלי. חבר את מערך הבדיקה הבודדת לספקטרומטר מסה לניתוח SCMS.

השתמש באצטון ניטריל המכיל 0.1% חומצה פורמית בטוהר של לפחות 99.9% כממס המיצוי והעביר אותו בקצב זרימה של 150 ננוליטר לדקה באמצעות משאבת מזרק. הגדר את פרמטרי ספקטרומטריית המסה עבור מצבי יונים חיוביים ושליליים. כעת, הנח את שני פתקי הכיסוי מקבוצה אחת וקבוצה שתיים יחד על שלב ה-XYZ הממונע של מערך SCMS של בדיקה בודדת והשתמש במיקרוסקופ כדי לבחור תאים באופן אקראי לניתוח.

לאחר רכישת ספקטרום מסה, נתח כ-30 תאים לקבוצה באמצעות אותו בדיקה בודדת, קצב זרימת ממס ומתח יינון. עיבד מראש את נתוני ה- SCMS הגולמיים באמצעות סקריפט R מותאם אישית והחל הסרת רקע ורעש ואחריו נורמליזציה של עוצמת היונים לזרם היונים הכולל. דה-איזוטופ של נתוני SCMS באמצעות איזוטופ MSD של חבילת Python.

בצע יישור שיא באמצעות סקריפט Python פנימי. החל רוחב סל של 0.01 יחס טעינה ראשי עבור binning וסובלנות מסה של 0.01 יחס טעינה ראשי או חמישה חלקים למיליון ליישור שיא. בצע ניתוח נתונים סטטיסטיים באמצעות Metabo Analyst 6.0.

בצע בדיקת T וצור מפת חום המציגה רמות מטבוליט יחסיות. בחר באפשרות המשמשת את 100 המטבוליטים המובילים ו-T-test או Inova כדי ליצור את 100 המטבוליטים המובילים המדורגים לפי משמעות ולשרטט מפת חום באמצעות 100 המטבוליטים המובילים הללו עם הבדלים משמעותיים. לבסוף, חפש את ערכי המטען הראשי המדויקים מול מסד הנתונים של מטבולום אנושי באמצעות סובלנות מסה של 10 חלקים למיליון לחיפוש במסד נתונים.

ניתוח רכיבים עיקריים במצב יונים חיוביים הראה שקבוצה אחת וקבוצה שתיים חופפות זה לזה, מה שמצביע על פרופילי מטבוליט דומים מאוד. במצב היונים השליליים, נצפתה דפוס דומה, אם כי קבוצה שתיים נראתה מעט יותר ברורה. ניתוח מפת חום של 100 המטבוליטים המובילים הראה דפוסי שפע עקביים ביותר בין קבוצה אחת לקבוצה שנייה בשני מצבי היונים.

לא נצפו תזוזות גדולות או אשכולות ספציפיים לקבוצה. למרות ששינויים קלים בכמה אשכולות מטבוליטים עשויים לשקף הבדלים ביעילות היינון או ביציבות המטבוליטים.