הדמיה של שומר הסף: ההערכה מבוססת הצבע הכחול של אוון על חדירות מחסום דם-מוח בדג זברה בוגר

מחקר זה מתמקד בפיתוח שיטה אמינה, פשוטה וחסכונית להערכת שלמות מחסום הדם-מוח בדג זברה בוגר. לרוב מחקרי דג הזברה אין דרך קלה ואמינה למדוד הפרעה במחסום הדם-מוח, והשיטות הקיימות הן לרוב מורכבות או יקרות. אז הפרוטוקול הזה מציע פתרון מעשי ובמחיר סביר.

פרוטוקול זה הוא פשוט, חסכוני ומשלב ניתוח ויזואלי ומדיד כאחד, כל זאת ללא צורך בציוד יקר או שלבים מסובכים. על ידי מתן פרוטוקול פשוט וניתן לשחזור, זה יקל על המעבדות לחקור שינויים נוירו-וסקולריים במודלים של מחלות דג זברה בוגרים. כדי להתחיל, הרדמו את דג הזברה על ידי הורדה הדרגתית של טמפרטורת המים מ-12 מעלות צלזיוס לשבע מעלות צלזיוס עד שהדג כבר לא מגיב לגירוי מישוש.

באמצעות מזרק אינסולין בקוטר 31, הזריקו 20 מיקרוליטר של 1% צבע אוונס כחול, או EB, לתוך החלל התוך-צפקי של הדג, והפעילו לחץ עדין באתר ההזרקה למשך 10 שניות כדי למנוע זרימה חוזרת. כעת העבירו את הדג למיכל התאוששות ואפשרו התאוששות למשך 30 דקות. עקוב אחר הדגים לאיתור פציעות, תמותה או שינויים התנהגותיים במהלך תקופה זו.

לביסוס בקרה חיובית, הכינו מחט סטרילית בגודל 31 המחוברת למזרק אינסולין לביצוע הליך פציעת פצע דקירה. לאחר תקופת התאוששות של 30 דקות, יש להרדים את הדג שוב, כפי שהודגם קודם לכן. מקם את הדג זקוף על משטח שטוח וקר, כגון חבילת ג'ל קרח.

הכנס את המחט לצד אחד של הקפלון בזווית של 90 מעלות לעומק שלא יעלה על 1.5 מילימטרים. לאחר מכן העבירו את הדג למיכל התאוששות ותנו לו להתאושש למשך 30 דקות. לאחר המתת חסד של הדג על ידי היפותרמיה, השתמש בלהב סטרילי או במספריים כירורגיים כדי לערוף את ראשו של הדג שהורדם.

שטפו את הראש פעמיים ב-1X PBS באמצעות יחס של 1:20 של דגים ל-PBS כדי להסיר עודפי דם וצבע כחול של אוונס. לאחר מכן מקבעים את הראש ב-4% פרפורמלדהיד באמצעות יחס של 1:20 בין דגים למקבעים, ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. הניחו את הראש הקבוע בצלחת פטרי נקייה ונתחו את המוח באמצעות פינצטה מחודדת.

הוסף PBS באופן רציף במהלך הדיסקציה כדי לשמור על לחות הרקמה ולמנוע התייבשות. שטפו את המוח המנותח פעמיים בשתי אמבטיות PBS נפרדות והניחו את הטישו על צלחת אגרוז של 1% כדי לשמור על לחות ולמנוע התכווצות. התבוננו ברקמות המוח המנותחות תחת מיקרוסקופ סטריאו.

כדי להתחיל בניתוח כמותני, הורד והתקן את תוכנת פיג'י ופתח את קובץ תמונת המוח בפיג'י. בצע דה-קונבולוציה של צבע על-ידי בחירה ב-Image, ולאחר מכן Color, Color Deconvolution ובחר RGB. התוצאה תהיה שלוש תמונות נפרדות המייצגות גוונים אדומים, ירוקים וכחולים.

כעת, הפעל את תמונת הערוץ הכחול, המכונה בדרך כלל צבע 3, על ידי לחיצה על התמונה. המירו אותו לגווני אפור של 8 סיביות באמצעות בחירה באפשרות 'תמונה', ולאחר מכן 'סוג' ו'8 סיביות'. לאחר מכן, כדי למדוד את עוצמת האפור של תמונה של 8 סיביות, קבעו את פרמטרי המדידה באמצעות בחירה באפשרות 'ניתוח' ו'קביעת מדידות'.

לאחר מכן בחר את האזור ואת ערך האפור הממוצע. בעזרת כלי בחירת המלבן, ציירו אזור עניין בגודל אחיד ומדדו את עוצמת האפור באמצעות בחירה באפשרות Analyze, ולאחר מכן Measure. דג זברה רגיל הציג גוון עור חום טיפוסי, ודג הזברה המוזרק EB הפגין גוון כחלחל בולט.

כדי לחקור את שלמות מחסום הדם-מוח במודל הפרקינסוני של דג הזברה הבוגר, הושוותה חדירת צבע EB לרקמות המוח בין ביקורת שהוזרקה במי מלח לבין דג זברה פרקינסוני. בקבוצת הביקורת השלילית, כלי הדם במוח נראו אדמדמים, מה שמעיד על היעדר אקסטרוואזציה של צבע EB. לעומת זאת, קבוצות הביקורת, הביקורת החיובית והפרקינסונית הראו כולן צבע כחלחל בכלי הדם במוח, מה שאישר זרימה מערכתית מוצלחת של צבע EB.

מוחות שנותחו מקבוצת הביקורת השלילית נראו לבנבנים עם כלי דם נראים בבירור, מה שאישר את היעדר צביעת EB. בקבוצת פגיעת הביקורת החיובית, צבע כחול עז סביב רקמת המוח הצביע על דליפת צבע עקב הפרעה מכוונת במחסום הדם-מוח. בקבוצה שהוזרקה במי מלח, צביעת EB נותרה מוגבלת לכלי הדם, מה שמעיד על מחסום דם-מוח שלם.

הקבוצה הפרקינסונית הראתה דפוס צביעה כחול כהה ומפוזר יותר, מה שמעיד על דליפה משמעותית של צבע EB ופגיעה במחסום הדם-מוח. ניתוח כמותי בגווני אפור חשף ערכי עוצמת אפור נמוכים משמעותית בקבוצת הפרקינסון בהשוואה לקבוצה שהוזרקה במי מלח.