מוטגנזה מדויקת של פאג'ים עם מערכות CRISPR-Cas בסיוע NgTET
14 באוקטובר 2025
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפחתת שינויים ב-DNA בבקטריופאג'ים באמצעות האנזים NgTET, המאפשר מוטגנזה יעילה וללא צלקות של CRISPR-Cas. שיטה זו מאפשרת הנדסה גנטית של פאג'ים ליישומים בביוטכנולוגיה וטיפול בפאג'ים.
אנו חוקרים זיהום פאג'ים ברמה המולקולרית. זה באמת מדע בסיסי. עם זאת, אנו לא רק עוסקים במדע הבסיסי, אנו גם להוטים לתרגם את המדע הבסיסי הזה ליישומים שבהם אנו משתמשים בידע זה כדי לחקור את זיהום הפאג'ים, ולהשתמש בו להנדסת פאג'ים וליישומים טיפוליים.
אחת ההתפתחויות האחרונות בתחום חקר הפאג'ים היא גילוי מערכת חיסון חיידקית. מערכת החיסון הזו קיימת בכל החיידקים והם זיהו או מייצרים כלים כדי להילחם באמת בפאג'ים. עם זאת, פאג'ים הם די חכמים.
פאג' הצליח לזהות גם כלים ולפתח כלים המאפשרים לו לברוח ממערכות החיסון הללו. וכלי אחד הוא למעשה שינוי הדנ"א שלו על ידי שינוי. וזה במיוחד עבורנו, ממש מעניין כי לחקור את הטבע הכימי של שינויי הדנ"א האלה שפאג'ים יצרו כדי לברוח ממערכת החיסון זה ממש מעניין, וגם מאפשר לנו להפוך לכלי להנדסת הפאג'ים בסוף.
בעשר השנים האחרונות פותחו טכנולוגיות נפלאות על ידי עמיתים גדולים ברחבי העולם. אחת הטכנולוגיות הללו היא למשל, ריצוף הדור הבא. בהתבסס על הטכנולוגיה הזו, אנחנו באמת יכולים לרצף פאג'ים, אבל גם את כל הגנום המארח ברמה המולקולרית.
מצד שני, פותחה ספקטרומטריית מסה, משהו כמו פרוטאומיקה. קריספר הוא כלי נפלא המיושם כיום בממלכות שונות של החיים. וגם אנחנו משתמשים בזה עכשיו כדי להנדס את הגנום של הפאג'ים.
אלה רק כמה טכנולוגיות נפלאות שעיצבו מחדש את האופן שבו אנו חושבים על פאג'ים כיום. כאשר אנו מדברים על האתגרים הנוכחיים, אחד האתגרים שאנו רואים הוא הנדסת ביו-קריספר של גנום פאג'ים. גנום הפאג'ים שונה לחלוטין עם שינויים ב-DNA, וה-ACEs הגרעיניים של CRISPR למעשה אינם מסוגלים לבקע את ה-DNA.
אז זה באמת אתגר שאנחנו צריכים להתגבר עליו אם אנחנו רוצים להנדס את הגנום של פאג'ים חיידקיים. הקבוצה שלי גילתה אבן בניין חדשה לחלוטין של רנ"א. גילינו שתעתיקים ספציפיים נושאים בחמשת הקצוות הראשוניים שלהם, מה שנקרא ספקטר חמצון, ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד קצר NAD, וגילינו זאת גם לאחרונה לראשונה באינטראקציות פאג'ים של E-coli T4.
בהתבסס על תגלית זו, זיהינו גם כי RNA וחלבונים יכולים לקיים אינטראקציה זה עם זה בדרך חדשה לחלוטין. גילינו שה-NAD הזה שתיארתי קודם פועל כמו דבק מולקולה כדי לקשר בין רנ"א וחלבונים זה לזה. התרוממות רוח זו של RNA היא דרך חדשה לחלוטין לאופן שבו RNA וחלבונים מתקשרים זה עם זה בטבע.
וגילינו את התגלית הזו באינטראקציה אקולוגית נגד פאג'ים. אנו גם להוטים כעת לתרגם את המדע הבסיסי הזה ליישומים, למשל, לתחום הטיפולים מבוססי הרנ"א. כדי להתחיל, טפל ב -500 מיקרוליטר של תרחיף פאג'ים עם 20 יחידות DNA 1.
הוסף שני מיקרוליטר של RNA AT1 מעורבב לשפופרת. דגרו את התערובת המטופלת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, טען 500 מיקרוליטר מתמיסת הפאג'ים המטופלת על גבי שיפוע סוכרוז מוכן.
צנטריפוגה את השיפוע ב 70, 000 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הדליקו את צינור הצנטריפוגה מלמטה כדי לדמיין את פס הפאג'ים העכור בשיפוע. לאחר מכן, בעזרת צינורית קהה, הסר בזהירות את השבר המכיל פאג' לתוך צינור אולטרה אולטרה-צנטריפוגה חדש.
כעת, הוסף 30 מיליליטר של מאגר TM קר כקרח לצינור ולצנטריפוגה. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר TM לאחר השלכת הסופרנטנט. אחסן את הפאג'ים התלויים בבקבוקון זכוכית בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הוסף מיקרוגרם אחד של פרוטאינאז K לפאג'ים התלויים. דוגרים על התערובת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן הוסף לדגימה נפח שווה של פנול כלורופורם, תערובת אלכוהול איזואמיל.
הפוך לערבב היטב וצנטריפוגה. העבירו את השלב המימי לצינור תגובה חדש, וחזרו על המיצוי שלוש פעמים. בצע שלוש עקירות כלורופורם חוזרות תוך שימוש בנפח שווה של כלורופורם כדי להסיר שאריות פנול.
לאחר מכן זרז את ה- DNA על ידי הוספת נפח של 0.1 נפח של שלושה נתרן אצטט מולארי ב- PH 5.5 ו- 2.5 נפחי אתנול. דוגרים על התערובת למשך הלילה במינוס 20 מעלות צלזיוס. למחרת, צנטריפוגה של הדגימה ב-15,000 גרם למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול את ה-DNA.
שטפו את כדור ה-DNA פעמיים עם 200 מיקרוליטר של אתנול 70%. נער בעדינות את הצינור והצנטריפוגה שוב. הסר בזהירות את הסופרנטנט.
לאחר מכן החייאה, השעו את ה-DNA המטוהר במים טהורים במיוחד. אחסן את ה-DNA במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. לחסן תאי Escherichia coli BL 21D 3 שהופכים הן עם הפלסמיד PET 28 NGTet, והן עם פלסמיד ביטוי CAS 12 או CAS 9.
גדל את התרבית במדיום LB עם תוספת אנטיביוטיקה מתאימה ב -37 מעלות צלזיוס עם טלטול. יש לעודד ביטוי של NG TED על ידי הוספת IPTG של 0.05 מילי-מולרי, ולדגור במשך שעתיים נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כבקרה, השווה זני E.coli BL 21 D3 עם ובלי ביטוי יתר של NgTET.
העבירו 300 מיקרוליטר מתרביות E.coli לצינור סטרילי. להדביק את התרבית בסוג T4 פראי או בפאג' שטופל ב-NgTET בריבוי הדבקה של 0.01. יש לערבב בעדינות כדי להבטיח פיזור אחיד של הפאג'ים ואז לדגור שוב.
הוסף את תערובת הפאג'ים של החיידקים לארבעה מיליליטר של מקדחה רכה LB המכילה 0.75% מקדחה ואנטיביוטיקה. מערבבים היטב, אך בעדינות כדי למנוע היווצרות בועות. יוצקים את תערובת המקדחה הרכה על צלחת מקדחה LB חמה מראש.
הניחו לצלחת להתמצק לזמן קצר בטמפרטורת החדר ודגרו למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, ספרו את הלוחות כדי לקבוע את מספר היחידות היוצרות פלאק. לבחירה נגדית, הדביק E.coli הטיל 13 מרווח באמצעות הפאג'ים לבחירה נגדית.
בצע את בחירת המונה באותם תנאים המשמשים למוטגנזה. לאחר הדגירה, סנן את ה-SUP natant דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר כדי להסיר פסולת חיידקית. השתמש בפאג'ים שנבחרו ומסוננים במונה לבדיקת פלאק על זן E.coli B כדי לבודד פלאקים בודדים לאימות במורד הזרם.
פס הפאג'ים נראה בבירור כאשר דגימת הפאג'ים T4 הייתה מרוכזת מספיק. ביטוי של חלבון NgTET ב-E.coli אושר על ידי פאג' SDS המראה את נוכחותו הן בשברים מסיסים והן בחלקים בלתי מסיסים לאחר ליזה וצנטריפוגה של תאים. כרומטוגרמות הראו כי השפע היחסי של דיוקסיאדנוזין, דיודוהידרוקסיקווינולין ותימידין לא השתנה בין סוג הבר ל-DNA של פאג' T4 שטופל ב-NgTET.
שפע נגזרות הציטוזין ששונו הופחת משמעותית ב-DNA הפאג'ים שטופל ב-NgTET בהשוואה לדגימה הלא מטופלת. פלסמיד המכיל את הגן NgTET, ואזורי הומולוגיה למוטגנזה ממוקדת נבנה באמצעות שיבוט שער זהב. בדיקת PCR אישרה הגברה מוצלחת של סוסת גן המטרה בנתיבים 2 עד 9 של ג'ל האגרוס, מה שמצביע על פגיעות חיוביות בקרב הפלאקים שנקטפו.
ב-DNA של פאג'ים מסוג T4 בטבע, השפע היחסי של 5 גליקוזילהידרוקסיאתיל 2 פריים דאוקסידין היה גבוה. ב-DNA של פאג' T4 שטופל ב-NgTET, רמות של 5 גליקוזילהידרוקסיאתיל 2 פריים דאוקסידין הופחתו מאוד בהשוואה לסוג הפראי. DNA פאג'ים T4 שטופל במוטציה הקטליטית הלא פעילה NgTET D234 A שמר על רמות גבוהות של 5 גליקולהידרוקסיאתיל 2 פריים דאוקסידין.
צאצאי פאג'ים T 4 ששוחזרו הראו רמות כמעט משוחזרות של 5 הידרוקסימתיל 2 פריים דאוקסידין, בהשוואה לסוג הבר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול להפחתת מודיפיקציות של DNA בבקטריופאגים באמצעות אנזים ה-NgTET, המאפשר מוטגנזה יעילה וללא צלקאות (scarless) באמצעות מערכת CRISPR-Cas. גישה זו שואפת לשפר את ההנדסה הגנטית של פאגים עבור יישומים שונים בביוטכנולוגיה ובטיפול פאגי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של פאגים
- הנדסה גנטית
- יישומים בביוטכנולוגיה
רקע
- זיהום בפאגים נחקר ברמה המולקולרית.
- הבנת זיהום בפאגים עשויה להוביל ליישומים טיפוליים.
- פיתוחים אחרונים כוללים את גילוין של מערכות חיסון בקטריאליות נגד פאגים.
- פאגים מפגינים מנגנונים מתוחכמים כדי לחמוק מהגנות בקטריאליות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה למוטגנזה יעילה באמצעות CRISPR-Cas בפאגים.
- מתן אפשרות לביצוע שינויים גנטיים ללא השארת עקבות (scarless) בבקטריופאגים.
- בחינת יישומים בתחומי הטיפול בפאגים והביוטכנולוגיה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש באנזים NgTET להפחתת מודיפיקציות ב-DNA.
- מערכת CRISPR-Cas למוטגנזה ממוקדת.
- פרוטוקולים ניסויים להנדסת פאגים.
- ניתוח של אינטראקציות בין פאגים לחיידקים.
תוצאות עיקריות
- הפחתה מוצלחת של מודיפיקציות ב-DNA בבקטריופאגים.
- יישום יעיל של מוטגנזה בשיטת CRISPR-Cas ללא השארת צלקות (scarless).
- פוטנציאל משופר ליישומים של הנדסת פאגים.
- תובנות לגבי מנגנוני זיהום של פאגים והגנות חיידקיות.
מסקנות
- האנזים NgTET יעיל לשינוי DNA של בקטריופאגים.
- שיטה זו פותחת נתיבים חדשים לטיפול בפאגים ולביוטכנולוגיה.
- הבנת האינטראקציות בין פאגים לבקטריות היא קריטית למחקרים עתידיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
התגברות על מחסומי מודיפיקציה של DNA של פאג'ים היא קריטית לאפשר מניפולציה גנטית מדויקת במחקר והנדסה של בקטריופאג'ים. מערכת CRISPR-Cas בסיוע NgTET נותנת מענה ישיר לאתגר של הפרעות הנובעות ממודיפיקציות של DNA, ובכך פותחת יכולות חדשות לגנומיקה פונקציונלית ולתכנון רציונלי של פאג'ים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי באימות מטרות ותומכת בהמשכיות תרגומית משלב הגילוי ועד ליישום טיפולי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תפקוד גנים בפאגים באמצעות מוטגנזה ספציפית לאתר ללא השארת צלקות.
- מסייע בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות לעריכות מדויקות ללא שיבוש של רשתות בקרה.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות במערכות פאג-מארח מורכבות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין וריאנטים של פאגים המוגדרים גנטית לצורך סריקה פנוטיפית בהמשך התהליך.
- משפר את הדירות של הבדיקה על ידי שמירה על ארכיטקטורת הגנים המקורית במהלך המוטגנזה.
- מאפשר הערכה כמותית של עריכות גנים באמצעות בדיקות פלאקים (plaque assays) ותיקוף מולקולרי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תומך בהנדסה רציונלית של פאגים עבור יישומים טיפוליים וביו-טכנולוגיים.
- שומר על רציפות תרגומית על ידי מזעור השפעות חוץ-מטרה ושימור פונקציות גנים חיוניות.
- מקל על קידומם של פאגים מהונדסים לעבר הערכה פרה-קלינית בהתאם לניתוח סיכונים.
אינטגרציה של תהליכי עבודה ושל שורש עיבוד (Pipeline)
שיטה זו נטמעת ברצף העבודה משלב הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לעריכות גנטיות מדויקות בפאגים, ובכך היא תומכת הן במחקר מונחה-השערות והן בהנדסה תרגומית.
- ביולוגיה של הגילוי: מספקת פלטפורמה לבדיקת היפותזות ולהבהרה של מסלולים באינטראקציות בין פאג למארח.
- סריקה: מספקת וריאנטים של פאגים שניתנים לשחזור ומוגדרים גנטית לצורך ניתוח השוואתי.
- אנליטיקה: תומכת במדידות כמותיות כגון ספירת פלאקים ואימות מולקולרי של עריכות.
- מחקר תרגומי: מתאימה פאגים מהונדסים למסלולי פיתוח טיפוליים על ידי שימור השלמות התפקודית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר עבור עריכת גנום של פאגים בפרויקטים מגוונים של מחקר והנדסה.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תפקוד של פאגים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה לעריכה גנומית לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת התהליך ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות להנדסת פאגים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום מועמדים של פאגים מהונדסים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מולקולרית, גנטיקה של פאגים ומערכות CRISPR-Cas.
- נדרשת גישה לציוד להפקת DNA, שיבוט מולקולרי ובדיקות פלאקים (plaque assays).
- נדרש סטנדרטיזציה בין צוותים עבור פרוטוקולים ניתנים לשחזור של מוטגנזה ותיקוף.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור מיני פאגים שונים או פרופילים שונים של מודיפיקציות ב-DNA.
- היעילות עשויה להשתנות בהתאם להיקף ולסוג מודיפיקציות ה-DNA של הפאג הקיימות.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
3:29
Sucrose Gradient Purification of Phage Particles for Downstream Analysis
4:47
Purification of Phage DNA via Organic Extraction and Ethanol Precipitation
6:20
Validation of Phage Editing via CRISPR-Cas Assays and Cas13a-Based Counterselection
8:45
Results
