In-Vitro התמיינות תאי T בזיכרון תושב CD8 באמצעות מערכת קו-קולטורציה של תא אורגנואיד-T אפיתל

המחקר שלנו בוחן את תאי הזיכרון של CD8 במערכת הרבייה הנשית, ובוחן כיצד זיהומים ומחלות משפיעים על מגוריהם, תפקודם, תחזוקתם ופוטנציאל הטיפול שלהם. השיטות הקיימות מגבילות את ההישרדות והיציבות הפנוטיפית של תאי T זיכרון תושבים. פרוטוקול זה מאפשר מחקר מעבדה ניתן להרחבה על ידי השראת הרקמה באמצעות תרבית תאי T אורגנואידיים.

כדי להתחיל, לוחית אורגנואידים אפיתליים נרתיקיים או VEOs בצפיפות של 10,000 תאים ב-20 מיקרוליטר של תמצית ממברנת בסיס לכל באר של לוח עם 24 בארים. הניחו את הצלחת באינקובטור ושמרו על התרביות במשך שבעה עד עשרה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. יום לפני הקולטורטורה, שאיפת מדיה של תרבית התאים מהבארות המיועדות ושוטפת את הבארות עם DPBS.

שואף את ה-DPBS, ואז משחרר 600 מיקרוליטר של EDTA מחומם מראש של 0.25% טריפסין לבאר. באמצעות פיפטת P1000 מצופה BSA, יש להשעות היטב את תמצית ממברנת הבסיס ולהעברת תכולת הבאר לצינור קוני סטרילי מצופה BSA בנפח 15 מיליליטר. עכשיו שים את הצינור הקוני באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

אחרי חמש דקות, הוסיפו 10 מיליליטר של 10% FBS ב-RPMI כדי לכבות את הטריפסיניזציה. לאחר מכן מניחים את הצינור בצנטריפוגה וסובבו בטמפרטורה של 500 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט. באמצעות קצה פיפטה מצופה BSA, החזירו את הכדור למרחק של 100 עד 300 מיקרוליטר של מדיום תרבית אורגני של תאי T או DMEMF 12 פשוט.

ספר את התאים באמצעות המוסיטומטר. חשב את נפח הווירוס הנדרש להשגת ריבוי זיהום של 0.1 באמצעות מספר התאים הכולל והטיטר הוויראלי הידוע. שאפו את מדיום תרבית התאים מבארות VEO שנבחרו לזיהום.

שטפו כל באר עם 500 מיקרוליטר של DPBS מחומם מראש והניחו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, השליכו את ה-DPBS. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיה אורגנואידית המכילה מספיק חלקיקי ויראליים כדי להשיג ריבוי זיהום של 0.1.

הניחו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך שעה, תוך סיבוב עדין של הצלחת ביד כל 20 עד 30 דקות. העבר את כמות תמצית ממברנת הבסיס הנדרשת לציפוי מאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס ל-4 מעלות צלזיוס ותן לה להפשיר במשך שמונה שעות. בדוק את ה-VEOs תחת מיקרוסקופ אור כדי להעריך את הגודל והבריאות הכללית.

אשר שה-VEOs הם בקוטר של כ-100 מיקרומטר עם מורפולוגיה עגולה אחידה ותאים בודדים מינימליים. שאיפת מדיום תרביות התאים מבארות VEO ושוטפים כל באר ב-500 מיקרוליטר של DPBS קר וסטרילי בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס. לאחר הסרת ה-DPBS, הוסף 200 עד 500 מיקרוליטר של תמיסת קצירת אורנואידים קרים לכל באר, כדי להבטיח נפח של לפחות פי 10 ביחס לטיפה של תמצית ממברנת הבסיס.

לאחר מכן, באמצעות פיפטת P200 מצופה BSA, משבש מכנית את תמצית ממברנת הבסיס. כעת הניחו את הלוח על רעיד אורביטלי שמוגדר לכ-100 סיבובים לדקה בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, משתמשים בקצה פיפטה מצופה BSA כדי לערבב ולהעביר את תוכן כל באר לצינור חרוטי סטרילי מצופה BSA בנפח 15 מיליליטר.

הנח את הצינור בצנטריפוגה וסובב בטמפרטורה של 500 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. אז זרוק את הסופרנטנט. שטוף את כדור ה-VEO עם חמישה עד 10 מיליליטר של DPBS קר וצנטריפוגה שוב בטמפרטורה של 500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

שואף את ה-DPBS, ואז השתמש בקצה פיפטה P1000, החזיר את הכדור למיליליטר אחד של מדיום תרבית אורגנואידי של תאי T, ומניח את תליית ה-VEO על קרח עד שתאי ה-T יהיו מוכנים לתרבות משותפת. לאיסוף תאי T, יש לבדוק את תאי ה-T במנוחה תחת מיקרוסקופ אור כדי להעריך את הגודל והבריאות הכללית. אשר כי תא ה-T מראה קיבוץ מסוים, מורפולוגיה מוגדלת, ואין שברי תא או שברים נראים לעין.

באמצעות פיפטת P1000, החזירו את תאי ה-T על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים בכל פינה של הבאר. אסוף צינור חרוטי וספור את סך תאי ה-T החיים של CD8. לאחר מכן, הניחו את מתלי תא ה-T בצנטריפוגה וסובבו בטמפרטורה של 584 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

להשליך את הסופרנטנט, ולהחזיר את כדור תא ה-T לתוך 10 מיליליטר של מדיום תרבית אורגנואידי של תאי T. לאחר מכן העבר את מספר התאים המתאים של T לצינור הקוני המכיל את ה-VEOs שהוכנו מראש כדי לשלב את התאים. הניחו את המתלה המשולב של VEO ותאי T בצנטריפוגה וסובבו שוב בטמפרטורה של 584 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר השלכת הסופרנאנט, החזירו את ה-VEOs ותאי T בנפח המתאים של תמצית ממברנת הבסיס. לאחר מכן, בעזרת קצה פיפטה נוסף, הצלחת את המתלה על לוח תרבית הרקמה המחומם מראש, ומפזרים 20 מיקרוליטר לבאר לפלטה עם 24 בארות. עכשיו הפוך את צלחת תרבית הרקמה והניח אותה הפוך באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.

יש להקדיש 30 דקות להיצמדות מלאה של תמצית ממברנת הבסיס. לאחר תקופת הדגירה, מוסיפים בזהירות את מדיום תרבית האורגנואידים המלאים של תאי T לכל באר. חלק 500 מיקרוליטר לבאר עבור צלחת 24 בארות או 250 מיקרוליטר לבאר עבור צלחת 96 בארות, והוסף את המדיה לצד הבאר כדי למנוע הפרעה לטיפה של ממברנת הבסיס.

החלף את מדיום התרבית כל יומיים עד שהדגימות ייאספו לניתוח ציטומטריית זרימה. עכברים בני שבעה ימים שנדבקו בווירוס דלקת המריוח הלימפוציטי המבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב הראו שכפול נגיפי שפע כבר ארבע שעות לאחר הקולטורציה המשותפת, כפי שנראה כאותות הפלואורסצנטיים בתוך האורגנואידים. הצטברות תאי T מסוג CD8 בקרבת אורגנואידים נגועים הפכה לבולטת בנקודות זמן מאוחרות יותר במהלך הקו-קולטורציה.

הצטברות הדרגתית של תאי T מסוג CD8 הייתה קשורה לירידה נראית לעין באות החלבון הפלואורסצנטי הצהוב באורגנואידים נגועים בנקודות זמן מאוחרות יותר. תאי T של CD8 שגודלו יחד עם VEOs נגועים הראו ביטוי מוגבר של CD69 ו-CD 103 לאורך זמן, מה שמעיד על רכישת פנוטיפ זיכרון תושב רקמה. תאי CD69 המופעלים על ידי אנטיגן, CD103 חיוביים, תאי T של CD8 הראו עלייה משמעותית בייצור אינטרפרון גמא ואינטרלוקין 2 תוך-תאי בהשוואה לביקורת לא מגורים.

פרוטוקול זה מאפשר מחקר חוץ גופי של תאי T זיכרון תושבי CD8, ומאפשר מניפולציה יעילה של תאי אפיתל ותאי T ללא הסתמכות על מודלים בעלי חיים. האתגר החשוב ביותר בפרוטוקול זה הוא שמירה על תאי T בריאים ובריאים ואורגנואידים אפיתליאליים נרתיקיים, שכן חיוניות לקויה או זיהום פוגעים בהישרדות משותפת ובתוצאות ניסויים. התמקדנו בניתוח ציטומטרי זרימה, אך ניתן לאסוף קו-תרביות לצביעה, הדמיה וריצוף.

המדיה הבטוחה מאפשרת את ELISA במורד הזרם.