הכנה ועיבוד עורקים מסויד עם מורפולוגיה ו-RNA משומרים לפרופילינג מרחבי דיגיטלי

טרנסקריפטומיקה מרחבית מציעה יתרון על פני מעקב RNA של תא יחיד ו-RNA בכמויות גדולות על ידי שמירה על מידע מרחבי בתוך הרקמה. באמצעות כלים כמו RNAscope, דה-קונבולוציה חישובית ומאגרי נתונים חד-תאיים זמינים לציבור, ניתן למפות התנהגות תאית לנישה ולפרופילי הגנים שלה ולבנות תמונה משולבת של ביולוגיית הרקמות. הטכנולוגיה הזו מתפוצצת.

שני מאמרים ב-Nature במאי 2025 מתמקדים במחקרי טרנסקריפטומיקה מרחבית. אם נמפה את PubMed, העקומה אף תלולה יותר: כ-150 מאמרים מרחביים ב-2023, כמעט 300 ב-2024, ובדרך לעבור את 500 הפרסומים ב-2025. טרנסקריפטומיקה מרחבית כבר עיצבה מחדש מספר תחומי מחקר מרכזיים, כמו ביולוגיה של סרטן, מדעי המוח, אימונולוגיה וביולוגיה התפתחותית.

ובכל זאת, הביולוגיה הוסקולרית מאחור. ההטרוגניות והגיאומטריה הייחודית של עורקים וורידים הופכות אותם למאתגרים בחיבור רקמות ושימור RNA. בנוסף, נגעים וסקולריים מתקדמים סובלים מהסתיידות וטרומבוזה, שמפחיתים עוד יותר את שלמות הרקמה.

פרוטוקול זה מיועד במיוחד למבנים דמויי כלי כלי. אנו כוללים גם שיטות להפחתת עלות ותהליכי צביעה נדרשים להערכת RNA, הפקדת סידן ותאים רלוונטיים. בהתחשב במחסור הנוכחי במחקרים ממוקדי כלי דם במחקר טרנסקריפטומיקה מרחבית בהשוואה לתחומים אחרים, פרוטוקול זה תוכנן להיות חסכוני וידידותי למתחילים, ומספק לחוקרי כלי דם כלים נגישים לאימוץ טרנסקריפטומיקה מרחבית במחקריהם.

פרוטוקול זה עשוי להיות גם מועיל לדגימות קבוצות גדולות לניסויים קליניים. בפרוטוקול זה אנו מתארים נהלים מפורטים הכוללים טיפול זהיר ברקמות עורקים מסוידות, שיטות סייד תכונות שמטרתן לשמור על איכות ה-RNA ומורפולוגיית הרקמות, טכניקות צביעה לאימות והכוונה במהלך בחירת ROI, וצביעת סמנים מורפולוגיים סופית על שקופיות מוכנות, כדי להבטיח שהן מוכנות לעיבוד במכשיר הפרופילר הדיגיטלי המרחבי. עורקי השוקה האנושיים, כולל העורקים הקדמיים של השוק, השוקה האחורית והפרינאום, נאספו מדגימות קטיעה של מטופלים ואוחסנו ב-DMEM המכילים 1% HEPES ו-1% Pen-Strep.

כל עורק מועבר לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ עם המדיה. רקמת חיבור פריוסקולרית עודפת מוסרת באמצעות מספריים סטריליים ומלקחיים, ונשארת רק דופן העורק. העורק החתוך מועבר לצלחת פטרי חדשה.

בתוך המנה מכינים קרש חיתוך סטרילי. העורקים נחתכים לקטעים של סנטימטר אחד באמצעות להב ניתוח. שני מקטעים מכל עורק מוקפאים בצינור קריו בחנקן נוזלי לשימור ואחסון לחלבון או RNA עתידי.

שאר המקטעים מונחים בצינורות של 15 מיליליטר המכילים 10% פורמלין בופר ניטרלי ומקובעים בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 עד 48 שעות. תמיסת דה-קלציפיקציה עם 10% EDTA בתמיסת ייצוב RNA מוכנה, ומכוונת את ה-pH ל-5.2 עבור התמיסה הפועלת. הרקמות הקבועות מועברות לצלחת חדשה המכילה PBS, והרקמות נשטפות לזמן קצר.

כל דגימה מועברת לצינור בנפח 15 מיליליטר המכיל תמיסת דה-קלציפיקציה ומערבבת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. לאחר סיום הדקלציפיקציה, הדגימות נשטפות פעמיים באמצעות PBS עם ערבוב עדין למשך חמש דקות. טישו מועברים לקלטות.

הקלטות מונחות למעבד רקמות. עיבוד פורמלין מתבצע לפחות ארבע שעות. הזמן יכול להשתנות בהתאם למטריצת הדגימה.

מספר קטעי עורקים ממוקמים בכל בלוק. הבלוק מלא בפרפין ומאפשר לו להתקרר לגמרי. השקופיות מוכנות על ידי סימון אזור הרקמה המוגבל בגב המגלגלים.

אשר שכל המקטעים נמצאים בתחום המוגבל הנדרש על ידי כלי ה-DSP של GeoMx. הפרפין העודף נחתך מהבלוקים. הבלוקים מחולקים ל-5 מיקרונים עם להבים פרופיל נמוך.

סרטי הרקמה מותקנים בתוך האזור המסומן. לפחות ארבעה חלקים סדרתיים לכל בלוק מותקנים עבור צביעות שונות בניסוי ה-DSP. אחסן את המחסניות בארבע מעלות צלזיוס עד השימוש.

לאחר מכן, מתבצעת היברידיזציה בשטח RNAscope, וכן צביעה היסטולוגית, על שקופיות מוכנות סדרתיות. בנוסף, סט נוסף של שקופיות מצופה בסמנים מורפולוגיים, כגון CD45 לתאי חיסון ו-alpha-SMA לתאי שריר חלק. הליך ההיברידיזציה המקומי של RNAscope כולל בקצרה ארבעה שלבים עיקריים: אפיית שקופית כטיפול מקדים, דה-פרפיניזציה סטנדרטית והידרציה מחודשת, שליפת מטרות, היברידיזציה של פרוב עם הגברת אותות וצביעת צבע לצורך ויזואליזציה של RNA.

לצורך אימות היסטולוגי, מתבצעים צביעת H&E וצביעת Alizarin Red S כדי לאפשר מיקום מדויק של משקעי הסידן. לבסוף, צביעת סמנים מורפולוגית מתבצעת באמצעות פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה סטנדרטי לזיהוי התאים הרלוונטיים, ומנחה את בחירת ה-ROI. במחקר זה הושוו שני פרוטוקולים מבוססי EDTA: אחד, 10% EDTA בלבד למשך 72 שעות, ושניים, 10% EDTA ותמיסת ייצוב RNA לאותו זמן.

המורפולוגיה ואיכות ה-RNA הוערכו באמצעות היברידיזציה בשטח RNAscope. שתי השיטות שמרו על ארכיטקטורת כלי הדם, אך שקופיות שטופלו בתמיסת ה-EDTA ובתמיסת מייצב ה-RNA הציגו אותות RNA חזקים בהרבה, כפי שמודגם בפאנל הימני, מה שמעיד כי תמיסת ייצוב RNA מגנה על תמלולים בעוד EDTA מצליח לסידן פוספט גבישי ומרכך בהדרגה את הדגימה מבלי להפעיל את ה-RNאזים. עם אופטימיזציה של אסטרטגיית שימור ה-RNA ואישור האיכות, אנו מדגימים את השלבים לצביעה היסטולוגית להצטברות סידן באמצעות המטוקסילין ואאוזין ואליזרין אדום S. אליזרין קושר באופן סלקטיבי מלחי סידן יוניים ומשתנה בגוון מכתום לאדום לבנים, ומדגיש ברגישות הסתיידות מיקרו ומקרו, אם כי הוא מספק פחות פרטים של מטריצות תאית וחוץ-תאית מאשר H&E.

שימוש בשני הכתמים ממקסם את המידע המבני והרכבי. לאחר צביעת סימנים מורפולוגיים, נסרקים שקופיות על פלטפורמת GeoMx. נוגדן CD45 מסמן תאי חיסון, בעוד שאקטין שריר חלק אלפא מסמן תאי שריר חלק וסקולריים הרבים במדיה.

ה-ROIs שנבחרו כוללים כ-100 עד 150 גרעינים עם תפוקת RNA מספקת. ה-ROIs הוצבו סמוך ורחוק מאזורים מסוידים כדי להשוות דפוסי ביטוי גנים מרחביים הרלוונטיים להסתיידות מדיאלית של עורק השוקה. למרות אובדן רקמה מסוים במהלך שלבי העיבוד המרובים, זוהו מספר ROI מתאימים בכל חתך עורק.

לסיכום, תהליך עבודה זה עוסק בטיפול ברקמת עורקים מסוידת ובדה-קלציפיקציה באמצעות צביעת אימות ובחירת ROI למחקר טרנסקריפטומיקה מרחבית. במיוחד, שילוב H&E עם צביעת אליזרין ספציפית לסידן מבטיח מיקום מדויק של הסתיידות כלי הדם וממקסם את המידע המבני וההרכב למיקום ROI. ניתוח RNAscope מראה כי קטעים עורקיים דה-קלציניים נשארים ברובם שלמים עם מספיק RNA.