הדמיית תאים חיים של הובלה אנדוציטית באמצעות ננו-גופים פונקציונליים בתאים מתורבתים

אנו חוקרים את התנועה האנדוציטית והרטרוגרדית של חלבונים טרנסממברנליים וכן את המנגנון שמעניק את ההעברה. כדי לחקור תנועת חלבונים מפני התא, נוגדנים קונבנציונליים משמשים בדרך כלל, אך הם עשויים לקדם קישור צולב ומיקוד ליזוזומלי. כדי להתחיל, יש להשיג כדור של חיידק Escherichia coli שעבר טרנספורמציה עם VHH-mCherry.

הוסף 30 מיליליטר של בופר קשירה קרח המכיל 20 מילימולר אימידאזול ב-PBS לכדור התא החיידקי. עם פיפטה, תלו את הכדור היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. העבר את התערובת התלויה לצינור צנטריפוגה מתויג בנפח 50 מיליליטר.

הוסיפו לתאים שהוחזרו ל-200 מיקרוגרם למיליליטר ליזוזים, 20 מיקרוגרם למיליליטר DNase I, מגנזיום כלוריד מילימולר אחד ופנילמתילסולפוניל פלואוריד אחד מילימולר. לאחר דגירה של הצינור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, הניחו אותו על רוטטור מקצה לצד וממשיכים את הדגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, הכנס קצה גלאי מוצק בקוטר שישה מ"מ של הסוניקוטור ישירות לתוך מתלה התא.

משבש מכנית את תאי החיידק באמצעות שלושה פולסי סוניקציה של דקה בעושר של 40% ומחזור עבודה של שנייה אחת דלוק ושנייה אחת כבויה. מה שמאפשר מרווח קירור של דקה אחת בין כל פעימה. לאחר הצנטריפוגה, שומרים את הליזאט הנקי על קרח תוך הכנה לכרומטוגרפיית זיקה למתכת משותקת, באמצעות עמודות טיהור תגיות חד-פעמיות ארוזות מראש המיועדות לפעולה בזרימת כבידה.

קבע עמודי חומצה ניקל-ניטרילוטריאצטית על מעמד מתכת או מחזיק עמוד מתאים. לאחר מכן רוקן את מאגר האחסון מהעמודה לחלוטין. איזון העמודה על ידי הוספת 10 מיליליטר של בופר קישור המכיל 20 מילימולר אימידאזול ב-PBS.

אפשר לבופר לעבור דרך כוח הכבידה. מרחו בהדרגה כ-30 מיליליטר של ליזאט החיידקי שנוקה על העמודה המאוזנת. תן לה לעבור דרך כוח הכבידה ותזרוק את הזרימה.

לאחר מכן שטפו את העמודה על ידי יישום שני נפחי קישור רצופים של 10 מיליליטר של בופר קישור המכיל 20 מילימולר אימידאזול ב-PBS. ניתן לשחרר את הננו-גופים הקשורים על ידי יישום שני מיליליטרים של בופר שחרור המכיל 500 מילימולר אימידאזול ב-PBS לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח שני מיליליטרים. איזון עמודת הסרת מלח שזרעה במתאם צינור של 50 מיליליטר על ידי שטיפה חמש פעמים עם חמישה מיליליטר של PBS.

תן לבופר להיכנס במלואו לשרף הדחוס, ואז להשליך את הזרימה דרכו. לאחר השטיפה הסופית, צנטריפוגה את העמודה בעוצמה של 1000 x גרם למשך שתי דקות. עכשיו העבר את העמוד עם המתאם לצינור איסוף חדש בנפח 50 מיליליטר אחרי שזרקת את הזרימה.

טעינו שני מיליליטרים של הגוף הננו-פונקציונלי המשוחרר על עמודת הסרת המלח המאוזנת מראש. לאחר מכן צנטריפוגה שוב ב-1000 x g למשך שתי דקות כדי לאסוף את האלואט לפני אימות ביטוי וטוהר VHH-mCherry. השיק את התוכנה של מערכת ההדמיה האוטומטית של תאים חיים.

העבר את תא המיקרוסקופיה האיבידי לשלב המיקרוסקופ. הגדר שני ערוצי הדמיה באמצעות מסנני גירוי ופליטה עבור EGFP ו-mCherry. בחר זמן חשיפה קצר ועוצמת תאורה נמוכה כדי להימנע מהלבנת פוטו.

שמור על ההגדרות קבועות בכל הניסויים. ההגדרות עשויות להשתנות בין עיתונאים. לכל תנאי, יש לאחסן קואורדינטות של 10 שדות ראייה שונים המכילים שלושה עד ארבעה תאים בפוקוס ברשימת נקודות.

לאחר מכן ללכוד תמונת מצב אחת של כל מיקום ברשימת הנקודות כדי לשמש כתמונת ייחוס לפני הוספת VHH-mCherry. כדי להתחיל אנדוציטוזיס, הוסף בעדינות 350 מיקרוליטר של תמיסת VHH-mCherry מחוממת מראש לכל באר תוך מזעור הפרעות לשכבה המונו. לאחר מכן ממשיכים ברכישת תמונות.

בצע רכישת טיימלפס ל-100 פריימים במרווחים 32 תוך שמירה על 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. כדי לנתח קליטת אנדוציטים של VHH-mCherry, טענו את מערכי תמונות הטיימלפס לתוכנת ניתוח התמונה. השתמש בכלי סגמנטציה ומעקב כדי לכמת פלואורסצנציה פנימית לאורך זמן באזורים שונים של עניין.

כל וריאנטים הננו-גופיים הפונקציונליים טוהרו לתפוקה גבוהה וטוהר גבוהים, כאשר רק VHH-mCherry הציג פירוק פרוטאוליטי קל. תוצרי הפירוק של VHH-mCherry אושרו כדומיינים בודדים של VHH-mCherry באמצעות זיהוי אימונובלוט ייחודי לאפיטופים. בהיעדר BirA, VHH-mCherry נמצאה בכמויות של כ-20 מיליגרם לכל תכשיר.

והביוטינילציה אושרה על ידי משיכת סטרפטווידין אגרוז לתערובות BSA. חלבוני מיזוג מתויגים ב-EGFP המובע בתאי HeLa הראו דפוסי מיקום תת-תאיים התואמים את מקביליהם האנדוגניים, כולל מיקום סביב גרעיני EGFP-CDMPR ו-EGFP-CIMPR. מיקום פרי-גרעיני בלעדי של EGFP-TGN46 ומיקום פריפריאלי של TfR-EGFP.

VHH-mCherry אפשר ויזואליזציה של הובלה אנדוציטית של EGFP-CDMPR בתאים חיים, והראה עלייה בקולוקליזציה במשך 60 דקות. קליטת VHH-mCherry לתאי הביטוי של EGFP-CDMPR הגיעה לרמה לאחר כ-43 דקות, עם מחצית חיים של תשע דקות. בתאים המבטאים TfR-EGFP, VHH-mCherry הצטבר במהירות בין-תאית עם מחצית חיים של ארבע דקות ורוויה לאחר 20 דקות.

הקמנו ערכת כלים רב-שימושית מבוססת ננו-גופים לניתוח הובלת כל חלבון טרנסממברנלי מפני השטח של התא. אנו משתמשים בננו-גופים פלואורסצנטיים כדי לסמן חלבוני מטען שטחיים ואז חוקרים את תנועת האנדוציטים שלהם באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים. עם הגישה שלנו להדמיית תאים חיים מבוססת ננו-גופים, אנו רוצים לחשוף מסלולים שמניעים הובלת מטען משטח לרשת טרנס-גולג'י.