November 21st, 2025
פרוטוקול זה מודד כמותית את היציבות ומחצית החיים של RNA מגביר בין-גני ותוך-גני בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות טיפול אקטינומיצין D, RT-qPCR וניתוח רגרסיה לא ליניארית. אסטרטגיות נרמול ספציפיות למיקום משולבות כדי למודל במדויק את דינמיקות דעיכת eRNA באופן תלוי הקשר.
המעבדה שלנו חוקרת אפיגנטיקה תוך התמקדות בשינוי RNA ומגבירים ברמה המולקולרית. לאחרונה מצאנו כי אנזים ה-RNA m5C Nsun2 מווסת על ידי משפר תוך-גני בתאי גזע עובריים בעכברים. כדי להתחיל, ציפו מראש את הבארות של צלחת תרבית תאים בת שישה בארות בשני מיליליטרים של ג'לטין בכל באר.
דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שאבו את הג'לטין מכל באר, ואז שטפו כל באר פעם אחת עם מיליליטר אחד של PBS. סטריליזציה של הלוחות על ידי הנחתן תחת אור אולטרה סגול למשך לפחות 15 דקות.
תאי גזע עובריים של עכבר זרעים על לוחות מצופים ג'לטין, תוך שימוש בשני מיליליטרים של מדיום תרבית תאים מלא בכל באר. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לחות עם 5% פחמן דו-חמצני. לאחר מכן, יש להמיס אקטינומיצין D בדימתיל סולפוקסיד כדי להכין תמיסת מקור בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר.
יומיים לאחר זריעת התאים או ביום הקציר, הוסף את תמיסת המאגר Actinomycin D למדיום הגידול. איסוף דגימות ב-0, 5, 10, 15, 20 ו-30 דקות לאחר הטיפול. לאחר עצר שעתוק, ביטוי RNA מגביר ירד במהירות תוך חמש דקות, בעוד ש-RNA שליח ירד בהדרגה ונשאר יציב יחסית במשך 30 דקות. ניתוח מחצית החיים גילה כי RNA משפרים הציגו מחצית חיים של כ-2 עד 3 דקות, בעוד של-RNA שליח הייתה מחצית חיים ארוכה משמעותית, מעל 60 דקות.
עבור RNA משפר בין-גני Pou5f1, נרמול ל-RNA שליח של TBP או לערך סף המחזור באפס דקות יצר הערכות מחצית חיים דומות. נתוני ריצוף RNA מתחילים הראו ערכי RPKM גבוהים באזור מגביר Nsun2 בהשוואה לביקורת שלילית. ניתוח RT-qPCR אישר ביטוי נורמל גבוה יותר של RNA מגביר בין-גני Nsun2 באזור משפר Nsun2 לעומת הביקורת השלילית.
שיטת הנורמליזציה המשמשת למגברים הבין-גניים מתאימה מכיוון שתבנית הביטוי ביחס לבקרה השלילית תואמת את הדפוס שנצפה באמצעות RPKM. המחקר שלנו מספק שיטה למדוד ולנרמל את חצי הקו הקצר של משפרים שמתדרדרים במהירות. אנו מטפלים בחוסר בשיטה ברורה להשוואת פעילות משפרים בין-גנית ותוך-גנית.
הוא מפשט את עיבוד הנתונים ומאפשר חישוב מהיר של דעיכת mESC באמצעות שלבים ברורים ומדויקים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
פרוטוקול זה מודד באופן כמותי את היציבות ואת מחצית החיים של RNAs מגביר בין-גנטיים ותוך-גנטיים בתאי גזע עובריים של עכבר באמצעות טיפול באקטינומיצין D, RT-qPCR, וניתוח רגרסיה לא ליניארי. אסטרטגיות נורמליזציה ספציפיות למיקום משולבות כדי לדגמן במדויק את הדינמיקה של ריקבון eRNA באופן תלוי הקשר.
Quantitative assessment of enhancer RNA (eRNA) stability in mouse embryonic stem cells addresses a critical gap in understanding transcriptional regulation dynamics during early discovery. Accurate measurement of eRNA decay kinetics enables mechanistic de-risking and informs target validation strategies for gene regulatory elements. This capability supports predictive confidence in modulating enhancer activity for therapeutic discovery pipelines.
This quantitative eRNA stability method integrates into the early discovery-to-lead identification continuum, supporting both hypothesis testing and downstream assay development.