הנדסה אפיגנטית של תאי K562: אסטרטגיה אפיזומלית דו-וקטורית למתילציה ממוקדת יציבה של DNA באמצעות חלבוני היתוך dCas9-DNMT3A ו-HDAC1

המחקר שלנו שואף לפתח מערכת יציבה ולא משולבת למתילציה ממוקדת של DNA, תוך חקירת עריכה אפיגנטית עמידה בתאי K562. התקדמות אחרונה בתחום כוללת מערכות CRISPR-dCas9 דו-אפקטוריות, המשלבות אנזימים אפיגנטיים לשינוי אפיגנטי סינרגטי, יציב ומקומי. כדי להתחיל, לשמור על תאי K562 בבקבוקי תרבית T75 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני ותנאים לחות.

כמת את ה-DNA האפיזומלי שישמש לטרנספקציה באמצעות ספקטרופוטומטר ב-260 ננומטר. השתמשו בשמונה מיקרוגרם של DNA פלסמיד סך בכל טרנספציה על ידי הכנת ארבעה מיקרוגרם מכל פלסמיד לקו-טרנספקציה, וערבבו את הכמות הנדרשת עם 90 מיקרוליטר מים אולטרה-טהורים. כעת, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תמיסת נתרן אצטט 3 מולר ו-2.5 נפחים של 100% אתנול לתמיסת ה-DNA המדוללת.

ערבבו היטב את תמיסת ה-DNA ודגרו אותה ללילה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס כדי לאפשר שקיעת DNA. ביום הבא, צנטריפוגה את צינור השקיעה של ה-DNA בטמפרטורה של 11,000 גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגית, יש להשליך בזהירות את הסופרנטנט מהצינור.

הוסיפו 500 מיקרוליטר של 70% אתנול לצינור כדי לשטוף את הכדור, וצנטריפוגה שוב ב-11,000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט של האתנול לחלוטין מהצינור, ותן לגלגלת ה-DNA להתייבש באוויר עד שלא יישאר אתנול נראה לעין. לאחר מכן, תלו מחדש את כדור ה-DNA היבש היטב ב-50 מיקרוליטר DMEM.

שמרו 400 ננוגרם מה-DNA המושקע מחדש, כ-2.5 מיקרוליטר בצינור חדש, ואחסנו את תמיסת הפלסמיד DMEM בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. הריץ את דגימת ה-DNA שנותרה על ג'ל 1% אגרוז כדי לוודא את טיהור ה-DNA ושלמותו. אספו תאי K562 מבקבוק T75 כאשר התרביות מגיעות ל-50 עד 60% חיבור כדי להבטיח יעילות טרנספקציה מיטבית.

ספרו את התאים שנאספו באמצעות המוציטומטר, והעבירו נפח שמכיל כפול 10 לכוח של חמישה תאים לתבנית תרבית בקוטר 35 מ"מ המכילה 900 מיקרוליטר DMEM ללא FBS או אנטיביוטיקה. הניחו את צלחת התרבית באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני כדי לשמור על התאים במצב מוכן לטרנספקציה. השתמשו בערכת טרנספקציה מבוססת ליפופקטמין כדי לספק פלסמידים בהתאם להוראות היצרן ולכוונון נפחים במידת הצורך.

הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של מגיב P3000 לתמיסת הפלסמיד DMEM שהוכנה מראש. ערבבו בעדינות, ודוגרו את התערובת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. כעת, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של תגובת ליפופקטמין 3000 יחד עם מספיק DMEM כדי להגיע לנפח סופי של 100 מיקרוליטר.

דגרו את תערובת הטרנספקציה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הוסיפו את כל 100 המיקרוליטרים של תערובת הטרנספקציה לצלחת התרבית בקוטר 35 מילימטר המכילה את התאים. נערו בעדינות את הצלחת כדי לפזר את התערובת באופן אחיד, ואז מחזירים אותה לאינקובטור.

ב-24 שעות לאחר הטרנספקציה, הוסף שלושה מיליליטר של DMEM מלא בתוספת 10% FBS ופעם אחת סטרפטומיצין פניצילין לכל צלחת כדי לעודד התרבות תאים שעברו טרנספקטים. ב-72 שעות לאחר הטרנספקציה, יש להתחיל בסלקציה על ידי הוספת אנטיביוטיקה G418 כדי להגיע לריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר. לאחר שתהליך הבחירה נקבע וספירת התאים הכוללת עולה על פי 10 לכוח של שש, יש לקצור את התאים בצנטריפוגה ב-300 גרם למשך שש דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.

שטפו את הכדור פעם אחת עם PBS סטרילי חד-פעמי, pH של כ-7.4, וצנטריפוגה שוב באותם תנאים. לאחר השעיית כדור התא הסופי ב-PBS חד-פעמי, קבעו את ריכוז התא באמצעות המוציטומטר. מדלל את ההתנגדות ל-10 להספק של שישה תאים למיליליטרים, כדי להבטיח שהתאים יתרחקו מחדש במלואם, ומעביר את התאים לצינור ציטומטריית זרימה.

לאחר מכן, התקן את מיין התאים המופעל על ידי פלואורסצנציה למצב תא יחיד באמצעות צלחת 96 בארות שטופלה בתרבות רקמה כמכשיר איסוף. כוון את הגדרות התוכנה בהתאם לכלי שבו משתמשים. שוטף את האוכלוסייה הראשונית על ידי בחירת תאים על בסיס פיזור קדמי ופיזור צדדי כדי לבודד את הגודל והגרנולריות הצפויים.

החריגו פסולת ותאים גרגיריים או מתים מאוד, והשתמשו בשטח פיזור קדמי לעומת גובה או שטח פיזור צד לעומת גובה כדי להשתמש בסינגלטים בשער. לאחר מכן, מלאו מראש כל באר של לוח עם 96 בארות ב-100 מיקרוליטר של מדיום מלא המכיל מיליגרם אחד לכל מיליליטר של G418, וחממו את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. בצע מיון תאים במצב תא יחיד, תוך שמירה על קצב מיון מתחת ל-300 אירועים בשנייה לשיפור הדיוק.

לאחר המיון, יש לבדוק כל באר תחת מיקרוסקופ כדי לאשר את קיומו של תא יחיד בכל באר, ומניחים את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני. אפשר לשיבוטים חד-תאיים להתרחב בנפרד בלוח של 96 בארים. לאחר שהצמיחה הקלונלית ניכרת, הוסף מדיום המכיל G418 מופחת לבארות לריכוז סופי של 400 מיקרוגרם למיליליטר כדי לשמור על לחץ בחירה.

העבר שיבוטים שגדלים היטב ברצף ללוחות עם 12 בארים, לאחר מכן לבקבוקי T25, ולבסוף לבקבוקי T75 לפי הצורך עד שכל שיבוט מגיע לכ-10 לכוח של שישה תאים. לאחר מכן, אספו כדורי תאים כפולים במרווחים קבועים. אחסן כדור אחד בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לצורך הפקת DNA גנומי.

הומוגניזציה של כדור שני ב-500 מיקרוליטר של תגובת טריזול, ואחסנו אותה מינוס 20 מעלות צלזיוס לצורך הפקת RNA וסינתזת DNA משלימה. הפקת DNA גנומי משכפולים נבחרים באמצעות הפקת פנול-כלורופורם ואחריה השקעת אתנול. הרחק מחדש את ה-DNA שהופק במלואו במים ללא נוקלאז או בופר TE.

מדוד את ריכוז ה-DNA והטוהר באמצעות ספקטרופוטומטר לפני שממשיכים במדרגות במורד הזרם. לבסוף, יש להפיק RNA מלא מהכדורים המאוחסנים באמצעות תגובת טריזול, ולאחר מכן משקעים איזופרופנול. תאים בודדים סווגו ללוחות של 96 בארות באמצעות מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה כדי לבודד את אלו הנושאים את שני המבנים.

ניתוח PCR של 10 שיבוטים מורחבים אישר שרק חלקם שמרו על שני המבנים, כפי שצוין על ידי רצועות של 230 זוגות בסיסים ו-205 זוגות בסיסים. פירוסיקוונסינג גילה כי השיבוט החיובי השני הראה עלייה במתילציה במספר אתרי CPG סמוך לאזור היעד של gRNA1 בהשוואה לביקורת שלא עברה טרנספקציה. אנו מתמודדים עם המחסור במערכות אספקה ארוכות טווח לא משולבות, ומאפשרות עריכה אפיגנטית מדויקת ויציבה מבלי לשנות את הגנום של המארח.

הממצאים שלנו מהווים כלי אמין לחקר ויסות גנים באמצעות מתילציה מטרה, ותומכים בפיתוח טיפולים אפיגנטיים מדויקים אפשריים. מחקרים עתידיים יחקרו שיפור ההובלה האפיזומלית, מזעור השפעות מטרה, שיפור יעילות Cas9 והתאמת המערכת למודלים ראשוניים או בחיים חיים.