Name: יצירה יעילה ומהירה של CAR-T ותאי הרג מונעים מציטוקין במכשירים הניתנים להרחבה GMP (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-05T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: למד פרוטוקול G-Rex להרחבה יעילה וניתנת להרחבה של תאי CAR-T ו-CIK לטיפול סרטן. שיטה זו מבטיחה צמיחה רובסטית ושימור פונקציונליות ליישומים קליניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer+as+personalized+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer.</a> Science. 348 (6230), 62-68 (2015).</li>
<li>Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">NK cells for cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).</li>
<li>Cappuzzello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+cytokine-induced+killer+cells+overcome+CAR-T+cell+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">How can cytokine-induced killer cells overcome CAR-T cell limits.</a> Front Immunol. 14, 1229540(2023).</li>
<li>Sharma, A., Schmidt-Wolf, I. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((30+years+of+CIK+cell+therapy%3A+Recapitulating+the+key+breakthroughs+and+future+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">30 years of CIK cell therapy: Recapitulating the key breakthroughs and future perspective.</a> J Exp Clin Cancer Res. 40, 388(2021).</li>
<li>Bayatipoor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NKT+cells+in+cancer+immunotherapy-from+bench+to+bed%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Role of NKT cells in cancer immunotherapy-from bench to bed.</a> Med Oncol. 40, 29(2022).</li>
<li>Hayday, A., Dechanet-Merville, J., Rossjohn, J., Silva-Santos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+by+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy by γδ T cells.</a> Science. 386, 6717(2024).</li>
<li>Rohaan, M. W., van den Berg, J. H., Kvistborg, P., Haanen, J. B. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+melanoma%3A+A+viable+treatment+option%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma: A viable treatment option.</a> J Immunother Cancer. 6, 102(2018).</li>
<li>June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li>
<li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+T+cells%3A+The+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineered T cells: The promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 16, 566-581 (2016).</li>
<li>Zhang, J., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+world+of+TCR-T+cell+trials+against+cancer%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Technol+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">The emerging world of TCR-T cell trials against cancer: A systematic review.</a> Technol Cancer Res Treat. 18, 1533033819831068(2019).</li>
<li>Sadelain, M., Brentjens, R., Rivière, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+principles+of+chimeric+antigen+receptor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">The basic principles of chimeric antigen receptor design.</a> Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).</li>
<li>Cappuzzello, E., Sommaggio, R., Zanovello, P., Rosato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+for+the+induction+of+antitumor+effectors%3A+The+paradigm+of+cytokine-induced+killer+%28CIK%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of cytokine-induced killer (CIK) cells.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 36, 99-105 (2017).</li>
<li>Palmerini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-free+protocol+for+the+ex+vivo+expansion+of+cytokine-induced+killer+cells+using+gas-permeable+static+culture+flasks%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A serum-free protocol for the ex vivo expansion of cytokine-induced killer cells using gas-permeable static culture flasks.</a> Cytotherapy. 22 (9), 511-518 (2020).</li>
<li>Pietà, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+therapeutic+strategy+for+B-cell+malignancies+that+combines+obinutuzumab+and+cytokine-induced+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Innovative therapeutic strategy for B-cell malignancies that combines obinutuzumab and cytokine-induced killer cells.</a> J Immunother Cancer. 9, e002475(2021).</li>
<li>Pievani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-functional+capability+of+CD3%2BCD56%2B+CIK+cells%2C+a+T-cell+subset+that+acquires+NK+function+and+retains+TCR-mediated+specific+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dual-functional capability of CD3+CD56+ CIK cells, a T-cell subset that acquires NK function and retains TCR-mediated specific cytotoxicity.</a> Blood. 118 (12), 3301-3310 (2011).</li>
<li>Cappuzzello, E., Tosi, A., Zanovello, P., Sommaggio, R., Rosato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retargeting+cytokine-induced+killer+cell+activity+by+CD16+engagement+with+clinical-grade+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22OncoImmunology%22%5BJournal%5D)">Retargeting cytokine-induced killer cell activity by CD16 engagement with clinical-grade antibodies.</a> OncoImmunology. 5, e1199311(2016).</li>
<li>Rambaldi, B., Rizzuto, G., Rambaldi, A., Introna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+and+unmodified+cellular+approaches+to+enhance+graft+versus+leukemia+effect%2C+without+increasing+graft+versus+host+disease%3A+The+use+of+allogeneic+cytokine-induced+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetically modified and unmodified cellular approaches to enhance graft versus leukemia effect, without increasing graft versus host disease: The use of allogeneic cytokine-induced killer cells.</a> Front Immunol. 15, 1459175(2024).</li>
<li>Rotte, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+correlation+for+CAR-T+cells%3A+A+systematic+review+of+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies.</a> J Immunother Cancer. 10, e005678(2022).</li>
<li>Zhang, Y., Schmidt-Wolf, I. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-year+update+of+the+international+registry+on+cytokine-induced+killer+cells+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ten-year update of the international registry on cytokine-induced killer cells in cancer immunotherapy.</a> J Cell Physiol. 235 (12), 9291-9303 (2020).</li>
<li>Garcia-Aponte, O. F., Herwig, C., Kozma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+expansion+in+bioreactors%3A+Upgrading+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte expansion in bioreactors: Upgrading adoptive cell therapy.</a> J Biol Eng. 15, 13(2021).</li>
<li>Smith, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+expansion+in+a+Xuri+Cell+Expansion+System+W25%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell expansion in a Xuri Cell Expansion System W25.</a> Methods Mol Biol. 2086, 151-163 (2020).</li>
<li>Ludwig, J., Hirschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+process+optimization+for+large-scale+CAR+T+expansion+using+the+G-Rex+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods and process optimization for large-scale CAR T expansion using the G-Rex cell culture platform.</a> Methods Mol Biol. 2086, 165-177 (2020).</li>
<li>Vera, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J Immunother. 33, 305-315 (2010).</li>
<li>Bajgain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+production+of+suspension+cells+using+the+G-Rex+%26%2334%3BM%26%2334%3B+series%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex &#34;M&#34; series.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14015(2014).</li>
<li>Talleur, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+CD27-depleted+cells+in+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cell+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Allogeneic CD27-depleted cells in adoptive cell therapy.</a> Adv Cell Gene Ther. 2, e45(2019).</li>
<li>Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+optimal+cytotoxic+activity+of+human+HER2%2Fneu-specific+CD8+T+cells+by+comparing+the+Cr-51+release+assay+to+the+xCELLigence+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determining optimal cytotoxic activity of human HER2/neu-specific CD8 T cells by comparing the Cr-51 release assay to the xCELLigence system.</a> J Vis Exp. (66), e3683(2012).</li>
<li>Eberhardt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+serum-free+media+on+the+expansion+and+functionality+of+CD19.CAR+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of serum-free media on the expansion and functionality of CD19.CAR T-cells.</a> Int J Mol Med. 52, 58(2023).</li>
<li>Cadiñanos-Garai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+temporal+mapping+of+CAR+T+cells+reveals+phenotypic+and+functional+remodeling+during+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing.</a> Mol Ther. 33, 2291-2309 (2025).</li>
<li>Wang, X., Byrne, M. E., Liu, C., Ma, M. T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+process+development+of+NK+and+CAR-NK+expansion+in+a+closed+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Scalable process development of NK and CAR-NK expansion in a closed bioreactor.</a> Front Immunol. 15, 1412378(2024).</li>
<li>Noldner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+lung+cancer+tumor-infiltrating+lymphocyte+%28TIL%29+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Improving lung cancer tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) manufacturing.</a> Cytotherapy. 27, 1240-1250 (2025).</li>
<li>Bandeira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+processing+of+lentiviral+vectors%3A+Releasing+bottlenecks%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Downstream processing of lentiviral vectors: Releasing bottlenecks.</a> Hum Gene Ther Methods. 23, 255-263 (2012).</li>
</ol>

טיפול תאי אימוץ (ACT) הפך לעמוד תווך חשוב של טיפולים מתקדמים לטיפול בסרטן. גישה זו מבוססת על מתן מוצרים תאיים מורחבים מחוץ לחיים להשגת יעילות אנטי-גידולית1. עד כה, סוגי תאים רבים שימשו ב-ACT, החל מגישות אנטי-ספציפיות, לדוגמה, רוצח טבעי (NK)2, רוצח מושרה ציטוקין (CIK)3,4, קוטל טבעי T (NKT)5, או γδ תאי T6, ועד תאי T ספציפיים ואישיים מאוד, כגון לימפוציטים חודרים לגידול (TILs)7 וטיפולים מהונדסים מבוססי תאים, כגון קולטן אנטיגן כימרי (CAR)1, 8 ותאי קולטני תאי T (TCR) 9,10.
תאי CAR-T הם תאי T מהונדסים גנטית שנוצרים על ידי טרנסדוקציה ויראלית אקס ויבו כדי לבטא קולטן חיסוני סינתטי שנועד לזהות מטרה מולקולרית מסוימת. מבנה ה-CAR מורכב מנוגדן משתנה שרשרת יחיד (scFv) ספציפי לאנטיגן, בשילוב עם תחומי איתות תוך-תאיים, כולל שרשרת TCRζ ומולקולות קוסטימולטוריות. בעת הפעלת האנטיגן, הדומיין התוך-תאי מספק אותות הפעלה המעודדים התרבות תאי T ופעילות אנטי-גידולית11.
תאי CIK הם אוכלוסייה הטרוגנית של לימפוציטים T מופעלים המקבלים ביטוי של CD56 במהלך התרחבות אקס ביבו, מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) או מדם חבל הטבור (UCB)12. הרחבה זו כוללת גירוי באמצעות אינטרפרון-γ (IFN-γ), נוגדן מונוקלונלי אנטי-CD3, ואינטרלוקין-2 (IL-2), ואחריה תרבית ב-IL-2 למשך 14 ימים. תאי CIK דומים פונקציונלית לתאי NK ו-T, ומפעילים פעילות אנטי-גידולית דרך מנגנונים תלויי קומפלקס היסטוקומפליטיות עיקרי (MHC) ותלויים 13,14,15,16. תכונות אלו מאפשרות שימוש בתאי CIK הן בסביבות טיפוליות אלוגניות והן באוטולוגיות עם סיכון מינימלי למחלת השתל נגד המארח (GvHD)17.
בפרקטיקה קלינית, גם טיפולי תאי CAR-T וגם CIK דורשים מתן של מספר רב של תאים. תאי CAR-T מוזרמים ב-50-200 מיליון מנות לכל מטופל18. באופן דומה, תאי CIK ניתנים בדרך כלל במינונים של עד 10 מיליארד תאים בכל עירוי, כאשר מטופלים מקבלים לעיתים קרובות מספר עירויים בהתאם לפרוטוקול הטיפול19. שיטות תרביות תאים מסורתיות המשתמשות בבקבוקים או לוחות אינן יעילות, גוזלות זמן ודורשות מעבר תכוף, מה שהופך את ההתרחבות בקנה מידה גדול לבלתי אפשרי ומעלה את הסיכון לזיהום. מערכות אוטומטיות או חצי-אוטומטיות המשתמשות בתרביות שקיות או ביוריאקטורים מאפשרות התרחבות רחבת היקף אך יש להן מגבלות, כלומר מאמץ גזירה או צורך בהתאמות צפיפות והזרמת נוזל בינונית תכופה20,21, וטיפול באצווה אחת בכל פעם, מה שמוביל לעלויות גבוהות הן בהקשרים אקדמיים והן בתחום. במצב מאתגר זה, חלופה מיוצגת על ידי מכשיר ההתפשטות המהירה החדירה לגז (G-Rex), שיטת תרבית סטטית הכוללת ממברנת סיליקון בתחתית הבאר, שמבטיחה חילוף חמצן יעיל וגובה מוגבר של כלי הים, ומאפשרת קיבולת בינונית בנפח גבוה. לכן, המערכת תומכת בצמיחת התאים ללא החלפת מדיום או התאמת צפיפות22,23. מערכות G-Rex-M הוכיחו יכולת הרחבה של עד 5000 מ"ל ותואמות למערכות קציר אוטומטיות, המספקות פלטפורמת תרביות סגורה וללא זיהום שניתן לתרגם בקלות מסביבות אקדמיות לקליניות לפיתוח מוצרי טיפול רפואיים מתקדמים (ATMPs)24.
בהליך שפורט, ניצלנו את היתרונות והמאפיינים של מכשירי G-Rex כדי לייעל את פרוטוקול ההרחבה של תאי CAR-T ו-CIK. הראינו שניתן להרחיב ולהגדיל את שני סוגי התאים ביעילות, תוך שמירה על פרופיל פנוטיפ ותפקודי עקבי במערכות תרביות שונות. סקירה סכמטית של פרוטוקול ההרחבה עבור תאי CIK ו-CAR-T מוצגת באיור 1.
<img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
איור 1: סקירה של פרוטוקולי הרחבת תאי CAR-T ו-CIK באמצעות מכשירי תרבית G-24 או G-6M. תאי CAR-T ו-CIK מתרחבים מ-PBMCs מבודדים החל מהיום ה-0. להרחבת תאי CAR-T, תאי PBMC מגרים ביום הראשון בנוגדנים נגד CD3 ו-anti-CD28, מהונדסים גנטית ביום השני, ולאחר מכן מתרבתים עם תוספי hIL-7 ו-hIL-15 כל 3-4 ימים, עם קציר סופי לבדיקות פונקציונליות ביום התשיעי. בפורמט G-6M, תוספת ציטוקינים מוגבלת ליום השני, ללא צורך בהזנה נוספת של ציטוקינים לאורך כל תקופת הגידול. להרחבת תאי CIK, PBMCs מעוררים ביום הראשון עם rhIFN-γ וביום 2 עם נוגדן אנטי-CD3 ו-rhIL-2, הניתן כל 3-4 ימים. ב-G-24, נדרש שינוי בינוני במקביל לתוסף הציטוקינים. תאי CIK נאספים ביום ה-14 לבדיקות פונקציונליות במורד הזרם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.</a>

<table><tbody><tr><td>בופר כתמים מבריקים</td><td>BD ביוסיינסס</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן CD28, אנטי-אנושי</td><td>מילטני ביוטק</td><td>130-093-375</td><td>שיבוט 15E8</td></tr><tr><td>נוגדן CD3, אנטי-אנושי</td><td>מילטני ביוטק</td><td>130-093-387</td><td>שיבוט OKT3</td></tr><tr><td>CD3 BV510</td><td>BD ביוסיינסס</td><td>740147</td><td>שיבוט UCHT1</td></tr><tr><td>CD314 APC (NKG2D)</td><td>ביולג'נד</td><td>320808</td><td>שיבוט 1D11</td></tr><tr><td>CD4 BV650</td><td>BD ביוסיינסס</td><td>563875</td><td>שיבוט SK3</td></tr><tr><td>CD45RA PerCP-Cy5.5</td><td>BD ביוסיינסס</td><td>563429</td><td>שיבוט HI100</td></tr><tr><td>CD56 PE</td><td>ביולג'נד</td><td>318306</td><td>שיבוט HCD56</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD ביוסיינסס</td><td>555543</td><td>שיבוט FREG-56</td></tr><tr><td>CD8 BV450</td><td>BD ביוסיינסס</td><td>562428</td><td>שיבוט RPA-T8</td></tr><tr><td>ערכת התרבות תאי סגול CellTrace</td><td>תרמופישר מדעי</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>תרמופישר מדעי</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco ו-Prime; s מלח עם בופר פוספט (D-PBS)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>לוחית E 16</td><td>אג'ילנט</td><td>5469813001</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS), ערך</td><td>תרמופישר סיינטיפיק</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>כתם חיוני 780 שניתן לתיקון (FVS780)</td><td>BD ביוסיינסס</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>פלטת באר G-Rex 24 &nbsp;</td><td>וילסון וולף</td><td>80192M</td><td></td></tr><tr><td>פלטת באר G-Rex 6M &nbsp;</td><td>וילסון וולף</td><td>80660M</td><td></td></tr><tr><td>פתרון מאגר HEPES</td><td>לונזה</td><td>ECM0180D</td><td></td></tr><tr><td>הנוגדן שלו</td><td>מילטני ביוטק</td><td>130-120-718</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין אנושי 20%</td><td>CSL בהרינג</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חלבון רקומביננטי IL-15 אנושי</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>חלבון רקומביננטי IL-7 אנושי</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa X-20</td><td>BD ביוסיינסס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>לימפופרפ</td><td>טכנולוגיות STEMCELL</td><td>18060</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>קו תאי סרטן השד &nbsp;</td></tr><tr><td>פניצילין וסטרפטומיצין</td><td>לונזה</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה פיזיולוגית (0.9% נתרן כלורי)</td><td>מוניקו</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרוטמין סולפט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P3369</td><td></td></tr><tr><td>ראג'י</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>קו התאים של לימפומה של בורקיט&nbsp;</td></tr><tr><td>IFN-גמא אנושית רקומביננטית</td><td>R& D Systems</td><td>285-IF-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 רקומביננטי (פרולוקין)</td><td>נוברטיס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rhCD19-שלו</td><td>Invitrogen</td><td>A42607</td><td></td></tr><tr><td>מכון רוזוול פארק ממוריאל 1640 (RPMI-1640)</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין יציב</td><td>לונזה</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טרייפן-בלו</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח תאים בזמן אמת xCELLigence</td><td>אג'ילנט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום תאים המטופואטיים ללא סרום X-VIVO 15</td><td>לונזה</td><td>02-053Q</td><td></td></tr></tbody></table>

יצירה יעילה ומהירה של car-t ותאי הרג מונעים מציטוקין במכשירים הניתנים להרחבה gmp

Efficient and Rapid Generation of CAR-T and Cytokine-Induced Killer Cells in GMP-scalable Devices

הפרוטוקול המתואר כאן מספק זרימת עבודה יעילה וחזקה להרחבה ולהנדסה של תאי אפקטור מחוץ לחיים מ-PBMCs מבודדים, כלומר תאי CAR-T ו-CIK. שיטה זו דורשת מניפולציה מינימלית של תאים ומנצלת את קיבולת החלפת הגזים של מכשירי G-Rex, ומספקת זמינות וכמות חמצון עדיפות יותר בהשוואה למערכות תרביות סטטיות קונבנציונליות23,24. יתרון מרכזי של פרוטוקול זה הוא יכולת ההרחבה הטבועה בו ממכשירים קטנים של 24 בארות (G-24), המתאימים למחקרים פרה-קליניים, ועד למכשירי 6M גדולים יותר (G-6M), התואמים לצרכי ייצור תרגומיים או קליניים, ללא צורך בשינויים בפרוטוקול מלבד קנה מידה פרופורציונלי.
באמצעות פרוטוקול זה, גם תאי CAR-T וגם תאי CIK הורחבו בהצלחה במקביל מ-PBMCs תורמים בריאים בפורמטים G-24 ו-G-6M, כפי שמתואר בסעיפים 2-4. בסיום תקופת התרבית, שני סוגי התאים הציגו התרחבות קיפול גבוהה וכדאיות, עם התרבות דומה בין שני פורמטי המכשירים (איור 2, טבלה משלימה 1, טבלה משלימה 2), מה שמדגיש את השחזוריות של הפרוטוקול בקני מידה שונים של תרביות.
כדי לאמת את יכולת ההרחבה של מכשירי התרבית, תאי האפקטור אופינו עוד יותר מבחינה פנוטיפית ותפקודית. עבור תאי CAR-T של CD19, כמתנו את ביטוי CAR והערכנו את תת-הקבוצות CD4+ ו-CD8+, תוך הבחנה בדומיננטיות של תאי T מסוג CD19 CAR+ CD8+ (איור 3A-B, טבלה משלימה 1). עבור תאי CIK, הערכנו את תדירות אוכלוסיות T (CD3+CD56-), NK (CD3-CD56+) ו-CIK (CD3+CD56+) (איור 3D), וכן את ביטוי הקולטן המפעיל NKG2D (איור 3E, טבלה משלימה 2). יתרה מזאת, ראינו פנוטיפים דומים ובביטוי של סמנים ספציפיים בין פורמטי התרבית G-24 ו-G-6M עבור תאי CAR-T ו-CIK. מצב ההבחנה של מוצרי תאי CD19 CAR-T ו-CIK נותח באמצעות צביעת CD62L ו-CD45RA (איור 3C-F, טבלה משלימה 1, טבלה משלימה 2), וחשף זיכרון ופנוטיפים דומים של אפקטור בין תאים שגודלו בפורמטים G-24 ו-G-6M. ממצאים אלו מראים כי הגדלת התהליך אינה פוגעת בשלמות הפנוטיפית או במצב ההתמיינות של אוכלוסיות תאי האפקטור המורחבות.
לבסוף, כדי להעריך עוצמה פונקציונלית, השתמשנו בבדיקות ציטוטוקסיות ספציפיות למטרה. גם תאי CD19 CAR-T וגם תאי CIK שהורחבו באחד מהמכשירים הראו פעילות ציטוליטית חזקה, מה שאישר את שמירת תכונות פונקציונליות בכל קנה מידה (איור 4). בסך הכול, תוצאות אלו תומכות בהתאמת המוצרים המורחבים ליישומים בהמשך הזרם במודלים פרה-קליניים ואולי גם בבדיקות קליניות.
<img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
איור 2: התרבות וחיוניות של תאי CAR-T ו-CIK של CD19. תאי CAR-T (n = 5) ותאי CIK (n = 6) שהורחבו מ-PBMCs בלוחות G-24 ו-G-6M נאספו ביום 9 ו-14 של ההתרחבות, בהתאמה, לביצוע ספירת תאים והערכת העלייה בקפלים (A-C) ואחוז (B-D) של תאים ברי קיימא. היסטוגרמות מייצגות את הביטוי הממוצע ± סטיית התקן (SD), והנקודות מציינות תורמים בודדים (ראו טבלה משלימה 1 וטבלה משלימה 2 לערכים בודדים). הנתונים נותחו באמצעות מבחן t זוגי דו-זנבי (A-C) או מבחן דירוג זוגות תואמים של וילקוקסון דו-זנבי מרובה (B-D), עם תיקון הולם-סידאק להשוואות מרובות (*p &lt; 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.</a>
<img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
איור 3: הערכת הפנוטיפ של תאי CD19 CAR-T ו-CIK התרחבה במכשירי G-24 ו-G-6M. הביטוי של מולקולות CAR בתאי CD19 CAR-T (n = 5) נותח באמצעות ציטומטריית זרימה כדי להעריך (A) את יעילות ההעברה בפרוטוקולי התרחבות G-24 ו-G-6M, וכן את הביטוי של (B) CD4+/CD8+ ו-(C) תתי-אוכלוסיות נאיביות/זיכרון בתת-הקבוצה CD3+CAR+. הפנוטיפ של תאי CIK בתפזורת (n = 6) נותח באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לבדוק (D) את אחוז CIK (CD3+CD56+), NK (CD3-CD56+) ו-T (CD3+CD56-), וכן את הביטוי של (E) NKG2D ו-(F) תת-אוכלוסייה נאיבית/זיכרון בתת-הקבוצה CD3+CD56+ (G-24 n=5, G-6M n=6). נאיבי (CD45RA+CD62L+), זיכרון מרכזי (CM, CD45RA-CD62L+), זיכרון אפקטור (EM, CD45RA-CD62L-), וזיכרון אפקטור חיובי CD45RA (EMRA, CD45RA+CD62L-). היסטוגרמות מייצגות את הביטוי הממוצע ± SD, והנקודות מציינות תורמים בודדים (ראו טבלה משלימה 1 וטבלה משלימה 2 לערכים אישיים). הנתונים נותחו באמצעות מבחן t זוגי דו-זנבי (B-C-D-F) או מבחן דירוג התאמה דו-זנבי של וילקוקסון (A-E), עם תיקון הולם-סידאק להשוואות מרובות (*p &lt; 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.</a>
<img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
איור 4: הערכת CD19 CAR-T וציטוטוקסיות של תאי CIK. (א) ניתוק ספציפי של תאי CD19 CAR-T (כתום, n = 5) או תאי UTD לא מועברים (אפור, n = 5) נגד קו תאי לימפומה של בורקיט ראג'י (כמודל קו תאי תלוי) בוצע באמצעות בדיקת הרג מבוססת ציטומטריה בזרימה של 6 שעות. התוצאות מוצגות כליזה הספציפית הממוצעת ± SD. (B) ציטוטוקסיות של תאי CIK שגודלו ב-G-24 (כחול בהיר, n = 7) או G-6M (כחול כהה, n=6) נגד קו התאים MCF-7 של סרטן השד (כמודל קו תאים דבק) ננטרה כל 15 דקות במשך 24 שעות באמצעות אנלייזר תאים בזמן אמת. התוצאות מוצגות כליזה הספציפית הממוצעת ± SEM. הנתונים נותחו על ידי מבחן מאן-וויטני, תיקון הולם-סידאק להשוואות מרובות (*p &lt; 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.</a>
איור משלים 1: אסטרטגיית גייטינג המשמשת לניתוחי ציטומטריית זרימה. גרפים מייצגים הממחישים את אסטרטגיות השער עבור (A) תא CAR-T ו-(B) אפיון פנוטיפי של תאי CIK, ו-(C) בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת צבע פלואורסצנטי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_Figure%201_RE.pdf" target="_blank">אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.</a>
טבלה משלימה 1: גדילה, חיוניות ופנוטיפ של תרביות תאי CAR-T של CD19 מתורמים בודדים. מספר התאים הכולל, עלייה בקיפול, חיוניות ואפיון פנוטיפי של תאי CD19-CAR T שנקטפו ביום 9 של התרבית במכשירי G-24 ו-G-6M מוצגים עבור כל תורם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_1_RE.xlsx" target="_blank">אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.</a>
טבלה משלימה 2: גדילה, חיוניות ופנוטיפ של תרביות תאי CIK מתורמים בודדים. מספר התאים הכולל, עלייה בקפלים, חיוניות ואפיון פנוטיפי של תאי CIK שנקטפו ביום ה-14 של התרבית במכשירי G-24 ו-G-6M מוצגים עבור כל תורם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_2_RE.xlsx" target="_blank">אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.</a>

יצירה יעילה ומהירה של CAR-T ותאי הרג מונעים מציטוקין במכשירים הניתנים להרחבה GMP

Adoptive cell therapies (ACT) have progressed rapidly in recent years, playing a pivotal role in cancer immunotherapy and significantly influencing ...

efficient-rapid-generation-car-t-cytokine-induced-killer-cells-gmp

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

פרוטוקול מהיר, פשוט וחסכוני עבור הדור של התורם הנגזרות multivirus ספציפי ההרג (rCTL) עבור עירוי כדי allogeneic hematopoietic בתאי גזע להשתלה (HSCT) מקבלי בסיכון לפתח זיהומים CMV, עו"ד או EBV. תהליך הייצור GMP תואמי וצריך להבטיח את יישום רחב יותר של חיסוני T-cell מעבר במרכזים מיוחדים.

דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic

ניתן למנף את ההשפעות הלימפודו-דפלטיביות והאימונומודולטוריות של טיפול סטנדרטי בכימותרפיה והקרנות כדי לשפר את היעילות האנטי-גידולית של אימונותרפיה של תאי T. אנו מתארים שיטה ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ספציפיים ל-EGFRvIII (CAR) ומתן אותם בהקשר של סטנדרט הטיפול בגליובלסטומה.

דור של תאי T CAR למאמצת תרפיה בהקשר של גליובלסטומה טיפול סטנדרטי

מטרת פרוטוקול זה היא לייצר תאי T בדרגה קלינית ספציפיים לפתוגן באמצעות מכשיר העשרת תאים אוטומטי מהדור השני המשלב מערכת לכידת ציטוקינים סגורה ואינו דורש צוות ייעודי או שימוש במתקן GMP. תאי T ספציפיים ל-pp65 שנוצרו יכולים להינתן ישירות לחולים.

העשרת תא אוטומטית של ציטומגלווירוס ספציפי תאי T ליישומים קליניים באמצעות מערכת ציטוקין ללכוד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לערוך גנטית לרכב-T תאים דרך CRISPR/Cas9 מערכת.

שימוש CRISPR/Cas9 כדי לשדוד את GM-שדרתי ב-T מכונית תאים

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור הדור של תאים CD8 T ספציפיים אנטיגן, ואת התרחבות שלהם בתוך מבחנה, עם מטרה של מספר גבוה מניב של תאי T פונקציונלי לשימוש מבחנה ובvivo.

יעילות גבוהה הדור של העכבר העיקרי של אנטיגן בתאי T ציטוטוקסיים לבדיקות פונקציונליות במודל סוכרת אוטואימוניות

מוצג פרוטוקול להרחבת מוצר התרופה תא גמא-דלתא (γδ) T. לימפוציטים מבודדים על ידי ההבהרה ומועשרים בחומצה זולדרונית ואינטרלוקין-2. תאי אלפא-ביתא T מתרוקנים באמצעות התקן הפרדה מגנטי ברמה קלינית. תאי γδ מתורבתים במשותף עם תאים מלאכותיים שמקורם ב- K562 ומורחבים.

הרחבה והעשרה של תאי T של גמא-דלתא (γδ) ממוצר אנושי כדורי

פרוטוקול זה מתאר את תהליך התמרת תאי T אנושיים ראשוניים עם גן מעניין, ומבטיח תאימות לתקני תנאי ייצור נאותים (GMP).

הליך תואם GMP לייצור תאי T מהונדסים גנטית

מאמר זה מפרט את תהליך הייצור של תאי T קולטני אנטיגן כימריים לשימוש קליני, במיוחד באמצעות מעבד תאים אוטומטי המסוגל לבצע התמרה נגיפית וטיפוח של תאי T. אנו מספקים המלצות ומתארים מלכודות שיש לקחת בחשבון במהלך תהליך הפיתוח והיישום של ניסוי קליני בשלב מוקדם.

ייצור תאי T של קולטן אנטיגן כימרי על מעבד תאים אוטומטי

פרוטוקול זה מייעל את הייצור הווקטורי הרטרו-ויראלי ואת התמרת תאי T מורין, ומאפשר ייצור יעיל של תאי CAR-T בעכבר.

ייצור יעיל של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T

כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת טיפות תחליב כפולות המכילות תא T אחד ותא מטרה סרטני כדי לבחון הרג תאים ברמת התא הבודד. שיטה זו מאפשרת כימות כפול הן של מולקולות ציטוטוקסיות והן של אפופטוזיס של תאי מטרה בתוך אוכלוסייה גדולה של תאי T.

בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת טיפות להערכת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ברמת התא הבודד

פרוטוקול מפורט מסופק לשימוש בטכנולוגיית CRISPR/Cas9 כדי להשיג דפיקה ממוקדת יעילה ביותר של מבנים גדולים ומולטי-ציסטרוניים בתאי T אנושיים ראשוניים באמצעות מסלול תיקון ה-DNA בתיווך הומולוגיה (HMEJ). תאי T המהונדסים עם פרוטוקול זה הניתן להתאמה ל-cGMP שומרים על התרחבות תאים מצוינת, ציטוטוקסיות וייצור ציטוקינים.

הנדסה לא ויראלית של תאי T אנושיים ראשוניים באמצעות אינטגרציה ממוקדת בתיווך הומולוגיה של תבניות DNA גדולות

למד פרוטוקול G-Rex להרחבה יעילה וניתנת להרחבה של תאי CAR-T ו-CIK לטיפול סרטן. שיטה זו מבטיחה צמיחה רובסטית ושימור פונקציונליות ליישומים קליניים.

יצירה יעילה ומהירה של CAR-T ותאי הרג מונעים מציטוקין במכשירים הניתנים להרחבה GMP

גלה סרטונים נוספים