מיקום של ממברנת הפלזמה וקולטני אצטילכולין ניקוטיניים תוך-תאיים באמצעות הדמיה כמותית בתאי יונקים
19 בדצמבר 2025
פרוטוקול זה מתאר ביטוי וכימות של תת-יחידות קולטני אצטילכולין נוירונליים באמצעות קו התאים Neuro-2a ביונקים. תגיות פלואורסצנטיות רגישות ל-pH ומיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרים הערכה מדויקת של מיקום הקולטנים בממברנת הפלזמה לעומת אלו המובעים במחלקות תוך-תאי ניטרליות pH, ומסייעים לחקר תנועת nAChR ומודולציה פרמקולוגית.
הבנת תנועת קולטני אצטילכולין ניקוטיני לממברנות פלזמה ביונקים היא קריטית לחקר ויסות מתווך על ידי צ'פרון ולהערכת טיפולים סלקטיביים ממוקדים. יתרון עיקרי של גלאים רגישים ל-pH בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית חיה של תאים הוא הרזולוציה המרחבית הגבוהה של מיקום תת-היחידות. כדי להתחיל, תגובות חימום מוקדם ל-37 מעלות צלזיוס.
הפשיר את תת-היחידה של nAChR DNase לחלוטין והביא את מגיב הטרנספקציה לטמפרטורת החדר. נקה את כל החומרים עם 70% אתנול לפני שמניחים אותם בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. כדי לבטא אלפא-7 nAChRs, בצינור מיקרו צנטריפוגה, יש לדלל את DNase אלפא-7 ו-NACHO פלסמיד לתוך מדיום סרום מצומצם.
ערבבו בעדינות על ידי פיפטינג לאחר הוספת DNA. לחילופין, כדי לבטא קולטני אלפא-4 בטא-2, יש לדלל 4 מיקרוגרם מכל תת-יחידה DNA לסך כולל של 250 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת ולערבב בעדינות. כוונן את יחסי תת-היחידות כדי לייעל את הביטוי של איזופורמים ספציפיים של קולטנים.
עבור קולטני אלפא-4 בטא-2 עם פלסמיד נוסף, הוסף כמויות שוות של DNA של כל פלסמיד. לאחר מכן, בצינור מיקרו צנטריפוגה חדש, מדלל 8 מיקרוליטר של תגובת טרנספקציה בנפילה ל-250 מיקרוליטר של מדיום סרום מצומצם. לאחר דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר, שלב את ה-DNase המדולל עם מגיב הטרנספקציה המדולל טיפה לתוך צינור.
מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בזמן שנוצרים קומפלקסים, החליפו את המדיום במנות התרבית ב-1 מיליליטר של EMEM ללא סרום. הוסף 500 מיקרוליטר של קומפלקס הטרנספקציה של DNA טיפה לכל צלחת.
ערבבו בעדינות על ידי נדנוד הצלחת כדי לפזר באופן אחיד, במיוחד על פני משטח הזכוכית התחתון. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות והחליפו את המדיום אחרי 4-6 שעות. הסר את המדיום הישן בשאיבה.
שטפו את הצלחת שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS למשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף 2 מיליליטר של בופר הדמיה pH 7.4 לצלחת. הכנס את צלחת ההדמיה למחזיק השקופית של מיקרוסקופ קונפוקלי ומניח את המחזיק בתא הסביבתי המחומם מראש.
חבר את צינור המשאבה הפריסטלטית למחזיק צלחות ההדמיה וסגור את תא הסביבה. כעת, השיק את תוכנת ההדמיה ובחר לייזרים עבור הפלואורופורים המעניינים. סרוק את הצלחת כדי לאתר תאים להדמיה באמצעות מטרת 10-60 x אובייקטיבית.
הגבר את ההגדלה אם רוצה, וכיוון את עומק המיקוד לפי הצורך. בחר את הרזולוציה המועדפת וצלם תמונה אחת באמצעות המטרה הרצויה. רשם את המיקום במפת הצלחת כדי להעביר את אותם תאים לאחר שינוי הבופר.
חזור על התמונה לכמה אזורים בצלחת עם אותן הגדרות צילום לכל התמונות. כשמשאירים רק את קו היציאה מחובר למשאבה הפריסטלטית, שואבים לאט את בופר ה-pH 7.4 מהצלחת אל מיכל פסולת. לאחר מכן העבר את קו הכניסה לבופר הקירור pH 5.5.
הפעל את המשאבה הפריסטלטית כדי להוסיף בופר pH 5.5 בקצב זרימה של 1.5 מיליליטר לדקה, כדי להבטיח שהתאים נשארים מחוברים. לאחר 20 דקות, כבו את המשאבה ודגרו את התאים בבופר למשך 20 דקות נוספות כדי לאפשר שיווי משקל. לאחר הדגירה, יש לבצע דימות חוזר של המיקומים השמורים.
כדי להתחיל בכימות תמונה, פתח את ImageJ וטען את התמונה לניתוח. התמונה תופיע כסטאק שבו כל ערוץ שצולם מוצג באותו פריים. נווט לערוץ הפאזה.
אם התמונה נראית בהירה מדי, בחר תהליך ובחר שיפור ניגודיות ואז לחץ על אישור. השתמש בכלי הזכוכית המגדלת כדי להתמקד בתא אחד. השתמש בכלי הבחירה החופשית כדי לעקוב אחרי קווי המתאר של התא בערוץ הפאזה. לאחר מכן עוברים לתעלה הפלואורסצנטית שמתאימה לפלואורופור המעניין.
הגדר את המדידות הרצויות על ידי בחירת ניתוח ולחיצה על Set Measurements. ודא שנבדקים שטח, ערך אפור ממוצע וצפיפות משולבת. כדי למדוד את האזור הנבחר, בחר בניתוח ואז לחץ על מדידה.
בצע שלוש מדידות רקע על ידי מעקב אחר אזורים ריקים ליד התא הנבחר. לאחר ביצוע המדידות לכל התאים הרצויים, העתק והדביק את נתוני המדידה לאקסל לניתוח. לאחר מכן חשב את ממוצע הרקע הממוצע מתוך שלושת מדידות הרקע.
חשב את ערך הפלואורסצנציה הכוללת של התא המתוקן או ערך CTCF עבור כל תא באמצעות הנוסחה שסופקה. באמצעות אותו תהליך עבודה, נתח תמונות שנרכשו לאחר שינוי בבופר. ייצוא את כל התוצאות לתוכנת ניתוח נתונים לעיבוד סטטיסטי.
צביעת אלפא-BTX AF647 חלשה נצפתה בתאי N2a שלא עברו טרנספקט, בעוד שזוהתה סימון נקודה חזקה בתאים שעברו טרנספקט DNA אלפא-7. הכימות אישר כי ביטוי ממברנת הפלזמה של nAChRs אלפא-7 היה גבוה משמעותית בתאי N2a שעברו טרנספקט אלפא-7 מאשר בבקרות שלא עברו טרנספקטים. ב-pH 7.4, היה נראה פלואורסצנציה מלאה של אלפא-7 pHuji בקרום הפלזמה.
בתאי N2a שעברו טרנפקט. ב-pH 5.5, הפלואורסצנציה של אלפא-7 pHuji הופחתה, וחשפה מיקום פנימי של הקולטנים. הפלואורסצנציה החיצונית של קולטני אלפא-7 pHuji הייתה הגורם המרכזי לביטוי הקולטנים.
הכימות הראה כי 82.6% מקולטני ה-pHuji של אלפא-7 היו ממוקמים על ממברנת הפלזמה, בעוד ש-17.4% היו פנימיים. הפלואורסצנציה שוחזרה עם החזרה ל-pH 7.4, מה שאישר את יכולת הפיכת אות ה-pHuji. ב-pH 7.4, תאי N2a שהביעו אלפא-4 SEP ובטא-2 pHuji הראו פלואורסצנציה ממברנלית חזקה לשתי תת-היחידות.
ב-pH 5.5, הפלואורסצנציה כובה, מה שמעיד על מיקום פנימי של תת-יחידות אלפא-4 SEP ובטא-2 pHuji. הכימות הראה כי 76.5% מ-SEP אלפא-4 היה בממברנת הפלזמה, ו-23.4% היה פנימי. בתאים שעברו שלושה טרנספקטים, אלפא-4 SEP הציג 82.8% מיקום ממברנה ו-17.2% ביטוי פנימי.
באותם תאים, 63.4% מתת-יחידות pHuji של בטא-2 היו ממוקמות על הממברנה בעוד 36.6% היו ממוקמות תוך-תאית. באמצעות הפרוטוקול שהוצג, אפיינו את השפעות המלווה החדשות על ביטוי וסחר בקולטני ניקוטין, והערכנו טיפולים סלקטיביים חדשים. יתרון של הפרוטוקול שלנו הוא גמישות לקולטני ניקוטין הומומריים והטרומריים, המאפשרים כימות של מיקום התא היחסי.
הגישה שלנו מאפשרת ביטוי מהיר וחזק של ממברנת הפלזמה של קולטני ניקוטין, המסייעת בניתוח סחר בתיווך מעקב ומאמצי גילוי תרופות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מפרט מתודולוגיות חסונות לביטוי ולכימות של מיקום על פני השטח לעומת מיקום תוך-תאי של קולטני ניקוטין לאצטילכולין עצביים (nAChRs) בתאי Neuro2a (N2a) של יונקים. על ידי שימוש בתגי פלואורסצנציה רגישים ל-pH ובמיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים חיים, הפרוטוקול מאפשר ויזואליזציה וכימות מדויקים של תתי-יחידות nAChR הומומריות והטרומריות, ובכך מקל על מחקרים של תעבורת קולטנים, השפעות של שפרונים ומודולציה פרמקולוגית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- נוירוביולוגיה תאית
- ביולוגיה של רצפטורים
- דימוי פלואורסצנציה
רקע
- קולטני nAChRs חיוניים להעברה סינפטית ומהווים יעדים לפיתוח טיפולי.
- ביטוי על פני השטח ותעבורה של nAChRs מווסתים על ידי חלבוני ליווי (chaperone proteins).
- כימות של אוכלוסיות קולטנים בממברנת הפלזמה לעומת קולטנים תוך-תאיים הוא חיוני להבנת הביולוגיה של הקולטן ומיקוד תרופתי.
- חלבונים פלואורסצנטיים רגישים ל-pH מאפשרים הבחנה בין קולטנים על פני השטח לקולטנים שהופנמו, בהתבסס על ה-pH הסביבתי.
מטרת המחקר
- ביסוס פרוטוקול מהימן לביטוי של תתי-יחידות nAChR בתאי N2a.
- כימות ההפצה של תתי-יחידות nAChR בין ממב冉 הפלזמה למדורים תוך-תאיים.
- מתן אפשרות לחקר תעתוע המתווך על ידי שאפרונים (chaperone-mediated trafficking) ומודולציה פרמקולוגית של nAChRs.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טרנספקציה של תאי N2a עם פלסמידים המקודדים לתתי-יחידות של nAChR המתויגות בחלבוני פלואורסצנציה מסוג pHuji או SEP.
- שימוש בריאגנטים לטרנספקציית DNA מבוססי ליפידים להחדרה יעילה של הפלסמידים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים חיים בתנאים ניטרליים (pH 7.4) ותנאים חומציים (pH 5.5) להבחנה בין קולטנים על פני השטח לקולטנים פנימיים.
- ניתוח תמונות כמותי באמצעות חישוב פלואורסצנציית תא כוללת מתוקנת (CTCF) בתוכנת ImageJ ועיבוד סטטיסטי.
תוצאות עיקריות
- הושגה הבעה חסונה של קולטני nAChRs מסוג alpha-7-pHuji ו-alpha-4-SEP/beta-2-pHuji בממברנה הפלזמית בתוך 24 שעות לאחר הטרנספקציה.
- ב-pH 7.4 נצפתה פלואורסצנציה חזקה של הממברנה; ב-pH 5.5 הפלואורסצנציה דוחקה, מה שחשף לוקליזציה פנימית של הקולטן.
- כימות הראה כי 82.6% מ-alpha-7-pHuji ו-76.5% מ-alpha-4-SEP היו ממוקמים בממברנה הפלזמית, בעוד שהשאר היו מופנמים.
- ניסויי טרנספקציה משולשת חשפו לוקליזציה דיפרנציאלית בממברנה לעומת לוקליזציה פנימית עבור תתי-היחידות alpha-4 ו-beta-2.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר כימות מהיר ואמין של מיקום תתי-היחידות של nAChR בתאים חיים.
- הוא ניתן להתאמה למחקר של nAChRs הומומריים והטרומריים כאחד, וכן לבחינת השפעות של ליגנדים ושפרונים.
- גישה זו תומכת במחקר של תעבורת רצפטורים, מודולציה פרמקולוגית ושינויים בביטוי nAChR הקשורים למחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי כמותי של לוקליזציית קולטני ניקוטין אצטילכולין עצביים (nAChR) בתאי יונקים נותן מענה לאתגר קריטי בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים עבור תהליכי פיתוח בתחום הנוירו-פרמקולוגיה. מתודולוגיה זו מאפשרת הערכה מדויקת של תעבורת קולטנים וביטוי על פני השטח, ומספקת מידע ישיר לבדיקת היפותזות טיפוליות בשלבים מוקדמים ולהערכת חלבוני ליווי (chaperone proteins). גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בזיהוי מולקולות מובילות (leads) ובמיון תיקי הפיתוח עבור גילוי תרופות המכוונות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בחינה כמותית של תעבורת nAChR ושל בקרה המתווכת על ידי צ'פרונים.
- תומכת בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי הבחנה בין אוכלוסיות רצפטורים בממברנה של הפלזמה לבין אלו התוך-תאיות.
- מסייעת בהפחתת סיכונים מכניסטיים עבור תרופות חדשניות סלקטיביות למטרה.
- מספקת נתונים מהימנים לתיעדוף של סוגי רצפטורים ואינטראקציות של צ'פרונים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות תאיות עברו ולידציה לצורך סריקת תרכובות ומחקרי מודולציה פרמקולוגית בשלבים הבאים.
- מספק תוצאות כמותיות סטנדרטיות וניתנות לשחזור באמצעות תגים פלואורסצנטיים רגישים ל-pH ודימות קונפוקאלי.
- מאפשר פיתוח בדיקות בעלות תוכן גבוה (high-content assay) עבור נקודות קצה של לוקליזציה ותעתוע של רצפטורים.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות על ביטוי רצפטורים על פני השטח של התא.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- מתאימה נתוני לוקליזציה של רצפטורים למודלים רלוונטיים למחלה לצורך פיתוח ביומרקרים טרנסלציונליים.
- מבטיחה המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות כימות השפעות פרמקולוגיות והשפעות של שפרונים (chaperones).
- מפחיתה סיכון ביולוגי בקידום מועמדים המכוונים לתתי-סוגים של nAChR המעורבים בהפרעות של ה-CNS.
- מספקת תובנות מכניסטיות לצורך קבלת החלטות על קידום מועמדים בהתאם להערכת הסיכונים.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
תהליך עבודה זה של דימות כמותי משלב שלבים החל מגילוי מוקדם, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד למחקר פרה-קליני, ובכך הוא תומך בבחינת השערות ובתיקוף מכניסטי של התערבויות המכוונות ל-nAChR.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקה מונחית-השערה של תעבורת רצפטורים וביטול השפעת שאפרונים (chaperone modulation).
- סריקה: מספקת קריאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות של פלואורסצנציית תא כוללת מתוקננת (CTCF) להשוואה סטטיסטית חסונה של מיקום הרצפטור.
- מחקר תרגומי: מקשרת נתוני מיקום רצפטורים למודלים של מחלות ואסטרטגיות של סמנים ביולוגיים כאשר הדבר נתמך על ידי ההקשר הניסויי.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה גמישה הניתנת להתאמה לסוגי רצפטורים נוספים, שאפרונים וליגנדים פלואורסצנטיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תעבורה של רצפטורים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי הדמיה וכימות לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין צוותי מו"פ.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתוני לוקליזציה ברי-ביצוע בשלב מוקדם של תהליך הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם-סיכון של תוכניות המכוונות ל-nAChR בהתבסס על מדדי תעבורה וביטוי על פני השטח כמותיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימות קונפוקאלי של תאים חיים ובניתוח פלואורסצנציה כמותי.
- מחייב גישה למיקרוסקופיה קונפוקאלית ולתוכנות לניתוח תמונות כגון ImageJ.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי הדימות ותהליכי העבודה לניתוח נתונים.
- ניתן להתאמה לסוגי nAChR שונים, לשפרונים (chaperones) וליגנדים פלואורסצנטיים, בהתאם לתכנון הניסויי.
- תלוי ביעילות טרנספקציה גבוהה ובבריאות התאים לצורך קבלת תוצאות הניתנות לשחזור.
שאלות נפוצות בביו-פרמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:21
Transfection of Neuro2a Cells with Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunits Using Lipid-Based Delivery
2:33
Confocal Imaging of pH-Sensitive Fluorescent Signals in Transfected Neuro2a Cells Using Live Buffer Exchange
4:34
Quantitative Analysis of Fluorescent Cell Images Using ImageJ to Calculate Corrected Total Cell Fluorescence (CTCF)
6:20
Results
8:32
Conclusion
