יצירת מודל מבוסס אורגנואידים בערמונית בעכבר לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן
February 27th, 2026
פרוטוקול זה מתאר את יצירת מודל אורגני מבוסס ערמונית בעכברים שגדל בדו-ממד. הוא כולל דיסוציאציה אורגנואידית, זריעת תאים, התמיינות, הערכת שלמות אפיתל וזיהום חוץ-גופי עם אשריכיה קולי אורופתוגנית. המודל מספק נגישות אפיקלית ומתאים לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן, תוך התגברות על מגבלות של מערכות אורגניות תלת-ממדיות מסורתיות.
מחקר זה מתמקד בהבנת האופן שבו פתוגנים של חיידקים מדביקים את אפיתל הערמונית, ואילו אינטראקציות עם המארחים קובעות את תוצאת ההדבקה. מודלים קיימים במבחנה תפסו בצורה לקויה את המגוון האפיתל של הערמונית. מודל זה מספק מערכת פיזיולוגית רלוונטית המשקפת את ההבדלים בין סוגי התאים הקיימים ברקמה.
כדי להתחיל, יש להשיג אורגנידים תלת-ממדיים של ערמונית עכברים שגודלו על טיפות של מטריצה חוץ-תאית בלוח 24 בארים. שאיבת המדיום ממספר הבארות הרצוי והוספה 500 מיקרוליטר של מדיום גידול טרי לכל באר. שימוש בפיפטה P 1000 משבש באופן מכני את הנפילה החוץ-תאית של המטריצה בכל באר.
אסוף את המתלה הזה בצינור קוני בנפח 15 מיליליטר שבו לא נאספו יותר משני בארות בכל צינור. הוסיפו מדיום תרבית טרי כדי להביא את הנפח ל-10 מיליליטר. הפוך בעדינות את הצינור שלוש עד ארבע פעמים לערבוב וצנטריפוגה בטמפרטורה של 450 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
שאפו את הסופרנטנט. תלה מחדש את הכדור בשני מיליליטר של תמיסת אנזימים, חמם מראש ל-37 מעלות צלזיוס ודגר את הכדור באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. באמצעות פיפטת P 1000 מערבבים את תליית התא כל חמש דקות במהלך הדגירה.
לאחר הדגירה, הוסיפו מדיום תרבית טרי כדי להגיע לנפח סופי של 10 מיליליטרים. הפכו בעדינות את הצינור שלוש עד ארבע פעמים כדי לערבב. צנטריפוגה ב-450 גרם לחמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
שאפו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. החזירו את הכדור לתלות ב-300 מיקרוליטר של מדיום תרבית, בתוספת 10 מעכבי סלעים מיקרומולריים. באמצעות תא ספירת נויבאואר סופרים את התאים במתלוי.
מדלל את ההתנגדות לריכוז של 62,500 תאים למיליליטר בחומר תרבית, בתוספת מעכב סלעים מיקרומולריים של 10. לאחר מכן זרעו 200 מיקרוליטר של המתלים לכל באר לפלטת 48 בארות ו-300 מיקרוליטר לבאר עבור מיקרו סליידס עם תאים. דגרו את הלוחות באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.
לאחר יום אחד, בדוק אם רוב התאים הבודדים התחברו למשטח התרבית הדו-ממדי. החלפת מדיום התרביות כל יומיים-שלושה והמשיכה בתרבות עד להגיע למפגש בתוך שבעה ימים. לצורך השראת התמיינות להעשרת תאי לומינל, הוסף 10 ננומולרים של חמישה אלפא דיהידרוטסטוסטרון או DHT לתסיית התא במהלך הזרעה.
יש להזריק את זן Escherichia coli האורופתוגני, או UPEC, על צלחת אגר LB עם תוספת של 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 24 שעות. באמצעות לולאה סטרילית, חיסון של שלושה מיליליטרים של ציר LB בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין עם מושבה חיידקית אחת.
דגרו את התרבית סטטית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 16 שעות. מערבולת, תרבית חיידקים בלילה. מדדו צפיפות אופטית של התרבית ב-600 ננומטר.
לאחר מכן, חשב את נפח התרבית הנדרש להשגת צפיפות אופטית התחלתית של 0.05 בשלושה מיליליטר של מרק. הוסיפו את נפח התרבית החיידקלית המחושב למרק LB טרי עם תוספת אמפיצילין. דגרו סטטית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
לאחר הדגירה, מערבלים את תרבית החיידקים. למדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר. חשב את נפח התרבית הנדרש להשגת צפיפות אופטית של אחד.
צנטריפוגה את הנפח הנדרש ב-12,000 גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. שאפו והשליכו את הסופרנטנט. החזירו את הכדור החיידקי למיליליטר אחד של פרימוס ותרבות אורגנית חופשית ללא DHT.
לאחר מכן, מדלל את השעון עם מדיום תרבית אורגני של ערמונית לעכבר כדי להשיג ריבוי זיהום של 100. שאפו את מדיום התרבות מהמודל המבוסס אורגנואידים המתוכנן. הוסיפו 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית המכיל חיידקים לכל באר של צלחת עם 48 בארות.
דגרו במשך שעה באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני. שאפו את המדיום המכיל חיידקים מהבארות ושטפו את הבארות שלוש פעמים עם מדיום תרבית טרי כדי להסיר חיידקים חוץ-תאיים. לאחר מכן, הוסיפו מדיום תרבית המכיל 50 מיקרוגרם גנטמיצין למיליליטר ודגרו במשך 30 דקות.
שאפו את המדיום. הוסיפו מדיום תרבית טרי, עם תוספת של 10 מיקרוגרם למיליליטר גנטמיצין למשך תקופת ההדבקה שנותרה. השתמשו במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לצלם את התאים הנגועים לאחר צביעת פלואורסצנטיות וכימות תאים נגועים באמצעות ציטומטר זרימה.
במצב ביקורת ללא דיהידרוטסטוסטרון, רוב התאים היו ציטוקרטין, חמישה תאים בסיסיים חיוביים, ורק מעטים הראו ביטוי לומינלי נמוך CD 24 8. תוספת של DHT ננומולר אחד יצרה אוכלוסיות לומינליות בסיסיות מעורבות, אם כי CD 24 A נשאר נמוך. הגדלת DHT ל-10 ננומולר קידמה התמיינות לתאים לומינליים, תוך שמירה על חלק מהתאים הבסיסיים לאחר שבעה ימי תרבית.
זה היה תואם למחקרי הכימות שהראו ירידה בציטוקרטין בחמישה תאי בסיס חיוביים ועלייה בתאי לומינל חיוביים CD 24A עם עלייה בריכוז DHT לאורך זמן. בשעה אפס לאחר ההדבקה, UPEC דבקה בתאי אפיתל במספרים גבוהים. לאחר טיפול בגנטמיצין שנמשך שעה, מספר התאים החיוביים ל-UPEC ירד בצורה חדה.
ב-24 שעות, מספר התאים הנגועים היה דומה לזה של שעה אחת. הדמיה קונפוקלית ב-24 שעות הראתה שחיידקים תוך-תאיים ממשיכים לשכפל וליצור אשכולות דמויי קהילה. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור דינמיקת זיהום חיידקי ואינטראקציות פתוגנים במודל השומר על מגוון תאי אפיתלי.
מחקרים עתידיים יכולים להשתמש במודל זה כדי לחקור מחלות ערמונית מגוונות, כולל זיהומים, ביולוגיה של סרטן ולבדוק תרכובות טיפוליות פוטנציאליות.
Overview
This article presents a step-by-step protocol for generating a two-dimensional (2D) culture model derived from mouse prostate organoids. The model maintains key epithelial characteristics and allows direct access to the apical surface, enabling detailed studies of host-pathogen interactions, particularly with uropathogenic Escherichia coli (UPEC). The protocol includes organoid dissociation, cell seeding, differentiation, and infection procedures, validated by immunofluorescence and functional assays.
Key Study Components
Area of Science
- Prostate epithelial biology
- Host-pathogen interactions
- Organoid and cell culture models
Background
- Prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia, prostatitis, and prostate cancer are prevalent in aging men.
- Organoid models replicate epithelial structure and function but limit access to the apical surface.
- Existing in vitro models do not fully capture the diversity of prostatic epithelial cells.
- Improved models are needed to study infection dynamics and disease mechanisms.
Purpose of Study
- To develop a physiologically relevant 2D culture system from mouse prostate organoids.
- To enable direct experimental access to the apical surface for infection studies.
- To validate the model's epithelial diversity and suitability for host-pathogen interaction research.
Methods Used
- Dissociation of mature mouse prostate organoids cultured in extracellular matrix.
- Seeding of dissociated cells onto 2D culture surfaces with optimized conditions for attachment and proliferation.
- Differentiation induction using dihydrotestosterone (DHT) supplementation.
- Infection of the 2D model with UPEC and analysis via immunofluorescence microscopy, TEER measurements, and flow cytometry.
Main Results
- The 2D model retained essential epithelial characteristics and cellular diversity.
- DHT supplementation modulated the balance between basal and luminal cell populations.
- UPEC adhered to and invaded epithelial cells, forming intracellular clusters observed by confocal microscopy.
- Gentamycin treatment effectively reduced extracellular bacteria, allowing study of intracellular infection dynamics.
Conclusions
- The 2D organoid-derived model provides a robust platform for studying prostate epithelial biology and host-pathogen interactions.
- It enables detailed investigation of infection dynamics and cellular responses.
- The model is suitable for future studies on prostate diseases and therapeutic testing.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Prostate organoid-derived 2D models address a critical gap in preclinical research by enabling direct interrogation of host-pathogen interactions at the epithelial barrier. This system preserves cellular diversity and barrier function, supporting predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking for infection and prostate disease research. The platform's translational relevance positions it as a reusable asset for portfolio-wide evaluation of disease mechanisms and therapeutic strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of epithelial responses to uropathogenic Escherichia coli infection.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets in a physiologically relevant context.
- Facilitates biological de-risking by modeling both basal and luminal cell populations.
- Improves predictive confidence for downstream infection biology studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible 2D epithelial system for quantitative infection assays.
- Enables direct access to the apical surface for compound or pathogen application.
- Supports TEER and immunofluorescence-based readouts for barrier integrity and cell differentiation.
- Allows scalable preparation for high-content screening of infection-modulating agents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant epithelial biology for translational infection and prostate disease models.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation of host-pathogen mechanisms.
- Enables risk-adjusted advancement of therapeutic hypotheses targeting epithelial infection pathways.
- Supports evaluation of candidate interventions in a system reflecting in vivo cellular diversity.
Pipeline & Workflow Integration
This organoid-based 2D model bridges early discovery and preclinical infection research, enabling hypothesis testing, target validation, and quantitative readouts within a unified workflow.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of infection mechanisms and epithelial responses.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative infection and barrier function assays for compound evaluation.
- Analytics: Provides immunofluorescence, TEER, and flow cytometry outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Maintains disease-relevant cellular organization for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse prostate disease and infection studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in infection biology.
- Operational Value: Standardizes epithelial infection assays with scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of infection and prostate disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, epithelial differentiation, and infection assays.
- Needs access to immunofluorescence microscopy, TEER instrumentation, and flow cytometry.
- Demands cross-team standardization of cell seeding, differentiation, and infection protocols.
- Adaptable to other epithelial models with protocol optimization for tissue specificity.
- Barrier function and cellular diversity must be validated for each experimental batch.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
3D Prostate Organoid Disruption into Single Cells
1:58
Plating Single-Cell Suspension onto a 2D Culture Surface
3:17
Preparation of Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) for Infecting the Organoids
5:12
Infecting the Prepared Prostate-Organoid Model with Uropathogenic Escherichia coli (UPEC)
6:16
Results
7:38
Conclusion
