טיהור יעיל של פוליפפטידים דמויי אלסטין (ELPs) מ-E. coli באמצעות שיטת חילוץ והשקעה מבוססת ממס אורגני

היקף מחקר זה שואל האם משקעים באמצעות חילוץ ממס יכול לטהר במהירות חלבוני מיזוג ELP תוך שמירה על תפקוד פעילות ההיתוך. פיתוחים אחרונים כוללים טיהור מהיר של ELP מבוסס ממס עם שיפור בשליטה באנדוטוקסין, המאפשר ננו-חלקיקים פעילים להרכבה עצמית להעברת חומצות גרעין ממוקדת. כדי להתחיל, שקלו גרם אחד של כדור תאי E.coli.

הוסיפו ארבעה מיליליטר של בופר ליזיס טרי כדי להחזיר את כדור התא. מערבולת בעדינות עד שהכדור מתפזר לחלוטין ומתערבב עם הבופר. הוסיפו כ-5 מיליגרם ליזוזים לתאים שהוחזרו כדי לסייע בעיכול דופן התא.

לאחר מכן מניחים את הצינור על קרח ודגרו במשך שעה. לאחר הדגירה, יש לסוניק את הדגימה באמצעות סוניקטר מיקרו-טיפ במרווחי חמש שניות. שמרו את הדגימה על הקרח והמשיכו בסוניקציה עד שמתקבל ליזאט אחיד חופשי מחלקיקים גלויים, בדרך כלל למשך חמש עד שמונה דקות.

צנטריפוגה את הסוניקט ליזאט ב-10,000 גרם למשך 10 דקות ב-20 מעלות צלזיוס כדי להבהיר זאת. לאחר מכן הפרדו בזהירות את הסופרנטנט המכיל את החלק המסיס מהפלט המכיל את השבר הבלתי מסיס. יש להוציא 10 עד 20 מיקרוליטרים של הסופרנטנט ולהחזיר מסה דומה של הכדור בבופר ליזיס.

מערבבים את שני החלקים עם 4x בופר Laemmli לריכוז סופי של 1x. לאחר מכן חממו את המתלה ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. אם ה-ELP מסיס בעיקר, יש להמשיך בהפקת ממס אורגני באמצעות הסופרנאנט המובהק.

לביצוע חילוץ ממס, הוסף ארבעה מיליליטר של ממס אורגני או תערובת ממס לכדור או לסופרנטנט המיובש באוויר. לתערובות ממס בינאריות, יש להשתמש ביחסי נפח מדויקים, כמו שני מיליליטרים מכל סוג לשילוב אחד לאחד. הפעילו את המתלה בעוצמה למשך דקה אחת כדי להבטיח חדירה נכונה של הממס לכדור.

כעת, דגרו את התערובת בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לאפשר הצטברות חלבונים חוץ-תאיים והמסה של ELP בשלב האורגני. צנטריפוגה את הדגימה בטמפרטורה של 13,000 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס כדי להפריד חלבונים ממוססים מפסולת בלתי מסיסה. אספו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור, שכן הוא מכיל את ה-ELP המסיס.

מדדו בדיוק את נפח הסופרנטנט שנאסף כדי להתכונן למשקעים. לאחר מכן, הוסיפו אצטון או אצטוניטריל לסופרנטנט בנפחו פי 2.33 לצורך שקיעת חלבון. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך חמש עד שבע דקות.

צנטריפוגה את הדגימה בטמפרטורה של 10,000 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להשליך את הסופרנטנט ולייבש את הכדור באוויר, או מתחת לזרם גז חנקן עדין למשך 10 עד 15 דקות, או על ידי הנחת צינורות צנטריפוגה פתוחים הפוך על מגבונים ללא סיבים במכסה אדים למשך שעה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. החזירו את כדור החלבון היבש ל-50 מיקרוליטר של PBS.

לאחר מכן פיפט למעלה ולמטה בעדינות כדי להבטיח המסה מוחלטת. אחסן את החלבון התלוי בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש קצר עד בינוני. כדי לבצע אימות באמצעות SDS-PAGE, תחילה מערבבים את החלבון המטוהר עם 4x SDS-PAGE buffer טעינה.

הוורטקס הוא הפתרון בקצרה להומוגניות. טעינו את הדגימה על ג'ל 10% SDS-PAGE ל-ELP ו-TEEN שמאוחדים לכוריסמט מוטאז. הרץ את הג'ל ב-100 עד 120 וולט עד שצלילת המעקב תגיע לתחתית.

עכשיו, צבעי את הג'ל עם צבע InstantBlue Coomassie או חלופה מתאימה לשעתיים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. שטוף במים דה-יוניים עד שנוצר רקע נקי. ELP ו-TEEN בולטים שהתמזגו לפס מוטאז כריזמטי הופיע בעוצמה של 100 קילודאלטון לאחר שלב ליזיס לפני ההפקה אורגנית.

שילובים שונים של ממס אורגני הביאו ליעילות ומגוון טוהר ההפקה של ELP ו-TEEN שהתמזגו לכריזמט מוטאז. תערובת ה-AG וה-BG הניבה את ההתאוששות הגבוהה ביותר של חלבון. הממס שהופק על ידי AG עם ELP ו-TEEN שהתמזגו לכוריסמט מוטאז שמרו על כ-80% מהפעילות האנזימטית שלו בהשוואה לחלבון מטוהר ב-ITC, בעוד ש-BG שמר על כ-50% פעילות, ובקרת V40 כמעט ולא הראתה פעילות.

ממצאים משמעותיים כוללים הוכחה כי משקעים בחילוץ ממס אורגני מטהר במהירות פיוז'ים של ELP עם אנדוטוקסין נמוך, תוך שמירה על פעילות חלבוני המיזוג. פרוטוקול זה מתמודד עם המחסור בשיטות מהירות ללא חומרי ניקוי לטיהור איחוי ELP מ-E.Coli עם או בלי גופי הכללה ללא ITC רב-שלבי. פרוטוקול זה מציע טיהור מהיר חד-שלבי ישירות מכדורי E.coli, המניב איחוי ELP טהורים מאוד ודלי אנדוטוקסין תוך שמירה על תפקוד חלבוני המיזוג.