השתלה תוך-שרירית של תאי גזע פלוריפוטנטיים במקור תאי גזע בלבלב בעכברים
10 באפריל 2026
אנו מספקים פרוטוקול זעיר-פולשני להשתלה תוך-שרירית של איי תאי גזע לבלב שמקורם בתאי גזע אנושיים לעכברים חסרי חיסון, לצורך השתלה ב-in vivo וניתוח בהמשך הזרם.
אנו חוקרים את התפתחות הלבלב האנדוקריני האנושי באמצעות עיניים שמקורן בתאי גזע כדי להבין את הבסיס הגנטי של הסוכרת. השתלת קפסולת כליה מסורתית היא פולשנית מאוד. פרוטוקול השתלות תוך-שריריות מציע אלטרנטיבה פשוטה, שכפולה וזעיר-פולשנית יותר.
כדי להתחיל, הוסיפו 0.5 מיליליטר של תמיסה אנטי-דבקה 5% לכסות את תחתית לוח מיקרובאר עם 24 בארות המכיל מיקרובארות פירמידליות הפוכות. צנטריפוגה את הצלחת ב-1,300 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן בדוק את המיקרובארות תחת מיקרוסקופ כדי למצוא בועות אוויר.
לאחר הצנטריפוגה מחדש של הצלחת, כדי להסיר אוויר כלוא, שאבו את התמיסה נגד הדבקות. לאחר מכן שטפו כל באר עם 0.5 מיליליטר של PBS וחזרו על שלב הכביסה שוב. לאחר מכן, שטפו את אבות הלבלב המתורבתים שהתפתחו מ-hPSC עם מיליליטר אחד של PBS עם EDTA של 0.5 מילימולר.
שאיפת ה-PBS עם EDTA של 0.5 מילימולר וכסה את הבארות בטריפסין. לאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך שמונה עד שתים עשרה דקות. מדלל את הטריפסין בשני נפחים של DMEM/F12 או PBS ותלה בעדינות את התאים על ידי פיפטינג.
העבר את המתלה לצינור קוני ומיד המשך לשלב הבא. צנטריפוגה את המתלים ב-200 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. שאופים בזהירות את הסופרנטנט והחזירו בעדינות את הכדור בטמפרטורה מדיום S4 מחומם מראש.
לאחר מכן, שאפו את ה-PBS מהצלחות של המיקרווול. הוסיפו בעדינות 1.25 מיליליטר מהתאים התלויים לכל באר בלוח המיקרווול. צנטריפוגה את הפלטה ב-100 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר כדי לפזר את התאים באופן שווה במיקרובארות.
העבר בזהירות את לוח המיקרווול לאינקובטור עם לח. כדי לבצע החלפות מדיה עם מדיום התמיינות, יש לשאוב בעדינות ולזרוק את המדיה לאורך קירות הבאר כדי למנוע טורבולנציה והזזת אשכולות תאים ממיקרובארות. לאחר העברת כמות מתאימה של אשכולות שנוצרו לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, מחברים את המזרק למכלול צינור המחט וממלאים אותו במדיום S7.
שאיפת האשכולות לתוך הצינור ישירות מצינור המיקרוצנטריפוגה. קפלו את הצינור לחצי והכניסו את החלק המקופל לקצה פיפטה בנפח 200 מיקרוליטר. לאחר מכן מכניסים את מכלול מחט קצה הצינור לצינור קוני בנפח 15 מיליליטר וקבע את הקצוות לשפת הצינור באמצעות סרט דבק.
צנטריפוגה את הצינור ב-100 גרם למשך שתי דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לדחוס את האשכולות ומניחים את הצינור מיד על קרח. כדי להשתיל את האשכולות לעכברי גמא המורדמים מסוג NOD scid, לגלח את החלק המדיאלי של הרגל הימנית מתחת לברך ולחטא ב-70% אתנול. לאחר מכן נתק את הצינור מקצה הפיפטה ומחבר אותו למזרק.
חתוך את הצינור קרוב לאשכולות הדחוסים וחבר אותו לקצה הקהה של המחט. דחוף את הסליין עד שהאשכול הראשון מגיע לקצה המחט. לאחר מכן מקם את העכבר על שכב, נוטה לצד ימין והאריך את הרגל הימנית.
הכנס את המחט לעומק של ארבעה עד חמישה מילימטרים לתא המדיאלי של הירך הימנית בין שרירי המקרב לשריר הגרציליס. לאחר מכן מזריקים את האשכולות תוך כדי משיכת המחט בכשלושה מילימטרים. סובבו את המזרק, משכו את המחט ותנו לעכבר להתאושש.
לאחר החלמת השתל שישה שבועות לאחר ההשתלה וחתך הרקמה, יש לבצע צביעה חיסונית כדי לאפשר ניתוחי הדמיה נוספים. תליות תא בודדות של אבות הלבלב בשלב ארבע הותקנו בלוחות מיקרווול ליצירת אגרגטים תלת-ממדיים מבוקרי גודל. בתוך 24 עד 48 שעות נוצרו אשכולות כדוריים דחוסים.
מיקרוסקופ פלואורסצנציה אישר נוכחות של תאי PDX1 ותאי מבטאי אינסולין בקווי hPSC של מדווחים. לאחר שישה שבועות, אתר השתל הוצג באופן מקרוסקופי עם גושים דמויי עין שניתן היה לזהות בתוך השריר. לאחר הכריתה, ניתן היה לזהות את האקספלאנטים תחת מיקרוסקופ סטריאו כמבני קשרים כדוריים בהירים.
זיהוי חזק של תאי C-פפטיד חיוביים נצפה בבעלי חיים שהושתלו. צביעת אינסולין אישרה את נוכחות תאי בטא אנושיים בתוך השתל. זוהו תאים חיוביים לגלוקגון וסומטוסטטין, מה שמעיד על שימור אוכלוסיות תאי אלפא ודלתא.
פרוטוקול זה מקל על בדיקות תפקודיות in vivo והערכת הישרדות ובשלות של שתלים אנושיים מושתלים. השיקול החשוב ביותר הוא להבטיח התמיינות איכותית של תאי גזע וטיפול עדין בתאים במהלך היווצרות אשכול כדי למקסם את החיוניות ולהבטיח הישרדות טובה של התאים. מודלים אלו מקלים על חקירת המנגנונים הגנטיים שמאחורי סוכרת מונוגנית ותפקוד לקוי של תאי בטא.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר JoVE זה מציג פרוטוקול מפורט להשתלה תוך-שרירית של אילי לבלב מז same-cell (SC-islets) המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) לעכברים עם חסר חיסוני. השיטה מציעה חלופה פחות פולשנית להשתלה בקפסולת הכליה או להשתלה תת-עורית, ומאפשרת גישה כירורגית פשוטה ושליפה אמינה של הש transplanted. הפרוטוקול תומך בהערכת תפקודי האיים באמצעות הפרשת אינסולין בה தூף גלוקוז (GSIS) in vivo לאחר אתגר גלוקוז פהי, ומקל על ביצוע אנליזות היסטולוגיות לאחר מכן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- רפואה רגנרטיבית
- טיפול בתאי גזע
- מחקר על סוכרת
רקע
- תאי אנדוקרין של הלבלב המופקים מ-hPSC טומנים בחובם פוטנציאל לטיפול תאי בסוכרת ולמידול מחלות.
- אתרי השתלה נוכחיים, כגון קפסולת הכליה או המרחב התת-עורי, מציבים מגבלות טכניות או פיזיולוגיות.
- השתלה in vivo נדרשת לרוב כדי לחקור את הבשלות והתפקוד של איים המופקים מתאי גזע בהקשר פיזיולוגי.
- קיים צורך באתרי השתלה הניתנים לשחזור ונגישים, המאפשרים שליפת השתלה והערכה תפקודית.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקול מפורט להשתלה תוך-שרירית של SC-islets המופקים מ-hPSC בעכברים עם חסר חיסוני.
- מתן אפשרות להערכת השתרשות, הישרדות ותפקוד של האיים באתר עם פולשנות מינימלית.
- תמיכה בהערכה תפקודית באמצעות GSIS in vivo וניתוח היסטולוגי לאחר ההשתלה.
- ביסוס מסגרת הדירה למחקר פרה-קליני על סוכרת תוך שימוש באיים המופקים מתאי גזע.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה ודחיסה של מקבצי איים תאים (SC-islet) הלקיחים מ-hPSC.
- ניתוח להשתלה תוך-שרירית בעכברים עם חסר חיסוני.
- הערכת הפרשת אינסולין מעודבדת גלוקוז (GSIS) in vivo לאחר אתגר גלוקוז אוראלי.
- שליפת השתל וניתוח היסטולוגי להערכה לאחר השתלה.
תוצאות עיקריות
- השתבשות (engraftment) והישרדות מוצלחות של איים המופקים מ-hPSC באתר השתלה תוך-שרירי.
- זיהוי הפרשת אינסולין תפקודית בתגובה לאתגר גלוקוז באמצעות GSIS in vivo.
- שליפה מהימנה של השסתים לצורך אנליזה היסטולוגית המאשרת את מבנה האיים ואת ביטוי הסמנים.
- הדגמה של שיטה הדירה, זעיר-פולשנית, למחקרי השתלת איים פרה-קליניים.
מסקנות
- השתלה תוך-שרירית היא אתר בר-ביצוע ונגיש להשתקת איים המופקים מ-hPSC בעכברים.
- ההליך תומך בהערכה תפקודית של איים המופקים מתאי גזע באמצעות GSIS in vivo.
- שליפת השתל מאפשרת ניתוח היסטולוגי ומולקולרי מקיף לאחר ההשתלה.
- פרוטוקול זה מספק מודל פרה-קליני הניתן לשחזור לקידום מחקרים בתרפיה תאית לסוכרת.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
השתלה תוך-שרירית של תאי אנדוקרין לבלב המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מספקת מודל פרה-קליני בעל פולשנות מינימלית הניתן לשחזור, לצורך פיתוח טיפולים תאיים לסוכרת. גישה זו מאפשרת הערכה תפקודית של איים המופקים מתאי גזע באמצעות מדידת הפרשת אינסולין המופעלת על ידי גלוקוז in vivo, ותומכת בשליפה אמינה של הש Transplant לצורך אנליזות המשך, ובכך נותנת מענה למגבלות מרכזיות של אתרי השתלה מסורתיים. השיטה מגבירה את רמת הוודאות החזויית בהערכה פרה-קלינית על ידי מתן הקשר פיזיולוגי להבשלה ולתפקוד של האיים, תוך שיפור הנגישות הכירורגית והפחתת הפולשנות בבעלי החיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות הערכת הבשלת התפקוד של איים המופקים מתאי גזע בהקשר פיזיולוגי.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות השתחב הנשמר ותגובת הפרשת אינסולין לרמות גלוקוז בעכברים עם חסר חיסוני.
- ערך אסטרטגי: מסייע בביסוס ביטחון חיזוי באישור של מטרות טיפוליות על ידי מתן תוצאות תפקודיות הניתנות לשחזור לפני שלב אופטימיזציית המולקולות המובילות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקת תרכובות בהמשך, באמצעות ביסוס השתרה תפקודית של איים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הליכי השתלה להבטחת הדירות ויכולת הרחבה במחקרים פרה-קליניים.
- ערך אסטרטגי: משפר את מוכנות הבדיקה על ידי מתן אפשרות לפלטי תפקודיים כמותיים באמצעות GSIS in vivo להערכת השפעת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על הרלוונטיות למחלה על ידי מידול תפקוד איים של לבלב אנושיים in vivo, ובכך תומך בהתאמה של ביומרקרים תרגומיים.
- ערך תפעולי: מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני, באמצעות שליפה עקבית של השתמרים ואנליזה היסטולוגית.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות על קידום הפרויקט בהתאם לסיכון, על ידי אספקת נתונים תפקודיים ומבניים על השתרעות והבשלה של האיים.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי על ידי תמיכה בבדיקת השערות בשלבי הגילוי המוקדמים, מתיימרת סטנדרטיזציה של בדיקות עבור סריקה, ומספקת תוצאות פונקציונליות המנחות את זיהוי המולקולות המובילות (lead identification) והחלטות על קידום לשלבים הפרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי הערכת תפקוד האיים באתר השתקה פיזיולוגי.
- סריקה: משפר את מוכנות הבדיקה באמצעות השתקה סטנדרטית ומדידות הדירות של הפרשת אינסולין בהשראת גלוקוז.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות של משתנים תלויים באמצעות GSIS in vivo להשוואת תפקודי השתלה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לניתוח היסטולוגי ומולקולרי של השתלות שהוצאו לצורך הערכת הבשלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה פרה-קלינית רב-פעמית למחזורי עיצוב-בדיקה איטרטיביים בפיתוח טיפולים לסוכרת המבוססים על תאי גזע.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בתפקוד ובהבשלה של איים המופקים מתאי גזע.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של הליכי השתלה בין אתרי מחקר שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) באמצעות אספקת נתונים תפקודיים אמינים, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים של תוכניות לטיפול בסוכרת.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מותאם סיכון באמצעות השתבצות (engraftment) שחזירה ותיקוף תפקודי של איים המופקים מתאי גזע.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיפרנציאציה של תאי גזע, טכניקות של השתלה מיקרו-כירורגית ובדיקות מטבוליות in vivo.
- תלוי בתשתית כירורגית סטרילית, במערכות לבדיקת עמיסות גלוקוז ובמבדקי זיהוי אינסולין לקבלת מדדים תפקודיים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין צוותי עיבוד התאים, הצוותים הכירורגיים והצוותים האנליטיים כדי להבטיח תוצאות עקביות.
- כולל שיקולי התאמה עבור זני עכברים אימונו-דפיציינטים שונים ולוחות זמנים של הבשלת איים.
- מוגבל על ידי הצורך בניטור לאחר ניתוח ובפרוצדורות לשליפת השתלים, העלולים להשפיע על התפוקה במחקרים רחבי היקף.
