נהלים לזיהוי מעכבי כניסה ל-SARS-CoV-2 כאנטי-ויראליים פוטנציאליים באמצעות פסאודו-וירוסים מבוססי MLV

המחקר שלנו מתמקד בזיהוי מעכבים החוסמים את כניסת SARS-CoV-2 באמצעות מערכות פסאודו-וירוס. חקר כניסת SARS-CoV-2 דורש לעיתים קרובות מעבדות בידוד ביו-בטיחותי גבוה, בדרך כלל BSL-3. פרוטוקול זה מאפשר סקר אנטי-ויראלי בטוח המשמש בפסאודו-וירוסים במעבדות BSL-2 סטנדרטיות.

כדי להתחיל, הניחו צלחת תרביות רקמה בת שישה בארות בארון הבטיחות הביולוגית וזרעו 7.5 פעמים 10 עד הכוח של חמישה תאים שמקורם ב-HEK 293 בכל באר בשני מיליליטר של מדיום שלם. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני במהלך הלילה. למחרת, יש לוודא שהתאים הגיעו לכ-50 עד 60% מזה.

ביום הבא, הכינו את תמיסת הפוליאתילנימין או PEI על ידי הוספת חמישה מיקרוליטרים של מיליגרם אחד לכל מיליליטר PEI ל-50 מיקרוליטר של מדיום סרום מצומצם בצינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. בצינור צנטריפוגה מיקרו נפרד בנפח 1.5 מיליליטר, יש להכין את תמיסת ה-DNA על ידי הוספת 2.5 מיקרוגרם GFP המבטא פלסמיד ל-50 מיקרוליטר מאותו מדיום. מערבבים כל צינור לזמן קצר על ידי מערבוב, ואז סובבו למטה חמש שניות ודגרו בטמפרטורת החדר.

במהלך 10 דקות הדגירה, יש להסיר בזהירות את המדיום מכל באר בלוח שש הבארות מבלי להפריע לשכבת התא המונו-לייר, ולהוסיף מיליליטר אחד של מדיום טרנספקציה מלא ללא אנטיביוטיקה. לאחר הדגירה, מוסיפים 50 מיקרוליטר של תמיסת ה-DNA לצינור המכיל את תמיסת PEI. ערבבו במהירות על ידי פיפטינג שש פעמים ודגרו בטמפרטורת החדר בדיוק שלוש דקות.

ואז מוסיפים במהירות את קומפלקס ה-DNA של PEI בזרם לבאר המתאימה. עכשיו, אטום את גבולות הלוח עם פאראפילם וצנטריפוגה ב-1000 גרם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ללא הפסקה באמצעות רוטור מתנדנד ודלי צלחות. לאחר הצנטריפוגה, הסר בעדינות את הפרפילם ודוגר את הפלטה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך שלוש שעות.

לאחר מכן החליפו בעדינות את מדיום הטרנספקציה בכל באר בשני מיליליטרים של מדיום DMEM מלא לפני חימום. דגרו את התאים שעברו טרנספקט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך 48 שעות, והערכו את יעילות הטרנספקציה על ידי הערכת ביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. זרעו תאים שמקורם ב-HEK 293T לשני לוחות 6 בארות כפי שהודגם קודם.

הקצה לוח אחד ליצירת וירוס מדומה מסוג SARS-CoV-2 ושני לווירוסים מדומים VSVG. הכינו את תערובת הטרנספקציה וקומפלקסי ה-PEI DNA ביום הניסוי ודוגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה, הסר בזהירות את המדיום מכל באר מתוך ששת לוחות הבאר מבלי להפריע לשכבת התא.

הוסף לאט מיליליטר אחד של מדיום טרנספקציה מלא מחומם מראש ללא אנטיביוטיקה לכל באר, כדי לאפשר למדיום לרדת לאורך קיר הבאר. הוסף את קומפלקסי הטרנספקציה המוכנים לתאים כדי להעביר אותם כפי שהודגם קודם. לאחר 48 שעות של דגירה לאחר ההעברה, אספו את הסופרנטנטים מכל באר לצינור צנטריפוגה קוני סטרילי בנפח 50 מיליליטר וצנטריפוגה בצנטריפוגה בטמפרטורה של 290 גרם למשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס.

אסוף את הסופרנטנט החופשי מהתאים וסינן אותו דרך יחידת סינון סטרילית של 0.45 מיקרומטר פוליווינילידן פלואוריד מעל בקבוק. הכינו אליקוטים של מיליליטר אחד של הסופרנטנט המסונן ואחסנו אותם בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס 2.5 כפול 10 לכוח של ארבעה תאי HSI, קו תאים רגיש מאוד ל-SARS-CoV-2 ב-50 מיקרוליטר DMEM מלא לכל באר בלוח תרבית רקמה של 96 בארות. הכינו ותויגו בארות משולשות לכל מצב לבדיקה, כולל זיהום וירוס פסאודו ללא ניצוץ ובקרות לא נגועות.

דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני במהלך הלילה. ביום ההעברה, יש להפשיר אליקו אחד מכל אצווה של וירוס מדומה על קרח ולערבב בעדינות באמצעות היפוך, כולל אליקו אחד של הבקרה ללא קוצים. הוסיפו את נפחי הכנת הווירוס הפסאודו הנדרשים ישירות לבארות המיועדים.

כוון את עוצמת כל באר ל-150 מיקרוליטר עם DMEM מלא. עכשיו, אטום את הפלטה עם פאראפילם וצנטריפוגה בטמפרטורה של 2,500 גרם למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר ללא הפסקה. הסר את אטם הפרפילם ודוגר את הפלטה במשך 72 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני.

לאחר הדגירה, יש להכין את תגובות בדיקת הלוציפראז לפי הוראות היצרן. הפשיר את מצע הלוציפראז ואת בופר ניתוח לוסיפראז 5X בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות. מדלל את בופר הליזה של בדיקת לוסיפראז פי 5 ל-1X עם מים סטריליים.

שאפו בזהירות והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסיפו 30 מיקרוליטר של בופר ליזיס 1X לכל באר. מניחים את הצלחת על מנער צלחת ונערו במשך 10 דקות במהירות של 150 סיבובים לדקה בטמפרטורת החדר.

בדוק את פירוק התאים המלא תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שהתאים עברו פירוק מלא ואינם ניתנים להבחנה. לאחר מכן העבר את הליזאטים לפלטת באר לבנה אטומה באורך 96. הוסף 50 מיקרוליטר של מצע לוסיפראז לכל באר.

ערבבו בקצרה על ידי תנועה עדינה של הלוח בתנועה מעגלית, הניחו את הלוח בתוך הלומינומטר ומדדו את הזוהר. זרע 2.5 כפול 10 לכוח של ארבעה תאי HSI ב-50 מיקרוליטר DMEM מלא לכל באר בלוח באר 96 כפי שתואר קודם. דגרו בלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני.

למחרת, הכינו דילול סדרתי אחד עד שלושה של התרכובות לבדיקה, כגון ארבידול ב-DMEM מלא המכיל 0.5% דימתיל סולפוקסיד. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, שואף בעדינות את המדיום מכל באר. הוסף 50 מיקרוליטר של דילול מורכב מתאים לכל באר תוך הוספת DMEM מלא בלבד לבארות הבקרה בעמודה 12.

דגרו במשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני. בלי להסיר את התרכובות, הוסף ישירות 50 מיקרוליטר של נגיף פסאודו של SARS-CoV-2 לכל באר מדוללת במדיה שלמה המכילה את אותם ריכוזי תרכובות. אטום את הפלטה עם פרפילם.

צנטריפוגה ב-2,500 גרם למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר ללא הפסקה. לאחר הסרת הפרפילם, דגרו את הלוח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך 72 שעות. לבסוף, כמת את ההדבקה באמצעות מבחן לוסיפראז כפי שהודגם קודם.

העברת תאים שמקורם ב-HEK 293T עם PEI מסועף הביאה ליעילות העברה גבוהה והניב כ-70% תאים חיוביים ל-GFP. 48 שעות אחרי הטרנספקציה. זיהום של תאי HSI רגישים בכמויות פוחתות של וירוסים פסאודו מסוג SARS-CoV-2 או וירוסים פסאודו VSVG הראה עלייה תלויה במינון בזוהר עם עלייה בקלט הווירוסים המדומים.

וירוסים פסאודוים ללא קוץ ותאים לא נגועים הראו רמות זוהר נמוכות מאוד. התרכובת ארבידול נבדקה בשל יכולתה לעכב כניסת פסאודו-וירוס והיא יצרה עיכוב ברור בתגובת מינון של פעילות הלוציפראז שנוצרה על ידי וירוסי פסאודו ספייק, עם עיכוב נמוך יותר שנצפה עבור וירוסים פסאודו VSVG. הבדיקה הראתה גורם Z ראשוני של 0.54, מה שמעיד על התאמה לצורכי סינון.

טיפול בארבידול בריכוזים שמתחילים מ-30 מיקרומולר לא השפיע באופן משמעותי על חיוניות התאים בהשוואה לתאים שטופלו רק ברכב דימתיל סולפוקסיד 0.5%. פרוטוקול זה אפשר ייצור וירוסים מדומים בעלי טיטר גבוה בתנאים אופטימליים. דבר זה מאפשר לחוקרים למדוד כניסת וירוס פסאודו ולזהות תרכובות המעכבות זיהום המתווך על ידי זיהום SARS-CoV-2.

יעילות טרנספקציה גבוהה קריטית ליצירת וירוסים פסאודו בעלי טיטר גבוה ולקבלת אותות זיהום אמינים במבחנים במורד הזרם. מערכת זו תומכת בסקר אנטי-ויראלי בקצב גבוה ובהפחתת ערך של מעכבי כניסה נגד וריאנטים מתפתחים של SARS-CoV-2, וניתן להתאים אותה בקלות ליצירת וירוסים מדומים המציגים חלבוני מעטפת מווירוסים אחרים.