מיפוי גנומי רחב של שינויים בהיסטונים ואתרי קישור לפקטורי שעתוק בקווי תאי סרטן ריאות נוירואנדוקריניים קטנים באמצעות CUT&RUN

לכן מטרת המחקר שלנו היא לזהות את האינטראקציות בין גורמי השעתוק המגדירים את השושלת לחלבוני שינוי הכרומטין בסוגים שונים של סרטן ריאות תאים קטנים, בוויסות נוף השעתוק, וכיצד אינטראקציות אלו יכולות לתרום לתהליכי מחלה, כולל התחלה והתקדמות הסרטן. אנו שואפים להשיג זאת באמצעות ניסויים כמו CUT&RUN, שהיא טכניקת ריצוף מהדור הבא שיכולה לפרופיל או לזהות בקנה מידה עולמי את המיקומים הגנומיים שבהם ההיסטונים הללו משנים באופן שונה וגורמי השעתוק הקשורים ל-DNA. בסופו של דבר, אנו מקווים לזהות מסלולים חדשים שמוסדרים אפיגנטית ועשויים להיות ניתנים לפעולה טיפולית בפיתוח טיפולים חדשים למטופלים עם סוג זה של סרטן ריאות.

בתחילה, הסר את תאי הנוירואנדוקריניים של סרטן הריאות הקטן שהתרבתו מהאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ובדקו אותם תחת מיקרוסקופ כדי לוודא את איכותם. לאחר מכן מעבירים את מתלה התא לצינור קונוסי בנפח 50 מיליליטר וצנטריפוגה את הצינור ב-1,200 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שואבים את המדיום מהצינור הקוני באמצעות הוואקום שבמכסה המנוע ושוטפים את פלטת התא המתקבלת ב-20 מיליליטר של PBS.

צנטריפוגה נוספת בצינור 1,200 גרם למשך חמש דקות, ושאופי את ה-PBS. הוסף אקוטאז לפי גודל הכדור ודוגר במשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לעיכול כדור התא. לאחר מכן, סיימו את העיכול על ידי הוספת חמישה מיליליטר של PBS עם 10% FBS וערבוב לקבלת תלייה חד-תאית.

לאחר צנטריפוגה נוספת של התאים כפי שהודגם קודם, החזירו את הכדור למרחק של חמישה מיליליטר של PBS. ספרו את התאים ההתחלתיים ואשמרו את הקיימות והשלמות שלהם באמצעות מונה התאים האוטומטי. חשב את מספר התאים הכולל הנדרש והוסף 20% עודף כדי להתחשב בשגיאות בפיפטינג.

העבר את מספר התאים הכולל המחושב לצינורות של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה את הצינורות ב-600 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. החזירו את התאים לבופר השטיפה בצפיפות של חמש כפול 10 לכוח של חמישה תאים בכל תגובה, לסך הכל שש תגובות. השתמש ב-100 מיקרוליטר של בופר בכל תגובה והשתמש בפיפטה בעדינות אך ביסודיות כדי להבטיח תלייה אחידה.

צנטריפוגה שוב את התאים, הסר את הסופרנטנט, וחזר על השטיפה. אליקווט 100 מיקרוליטר של תאים שטופים לכל צינור במערכת שמונה רצועות המכילה 10 מיקרוליטר של חרוזי קונקנאבלין A פעילים. בעדינות פיפטה כדי לערבב את התכולה.

דגרו את תערובת תאי החרוזים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר קשירת התאים לחרוזים, וסובבו במהירות את הצינורות בצנטריפוגה קטנה כדי לאסוף את התערובת מבלי לאפשר לחרוזים לשקוע. הנח את הצינורות על מתקן מגנט של צינורות בנפח 0.2 מיליליטר. תן לתערובת להתפזר ולתת לפיפטה להסיר את הסופרנטנט.

לאחר מכן הסר את הצינורות מהמגנט. מיד הוסיפו 50 מיקרוליטר של בופר נוגדנים קרים לכל תגובה והפיפטה בעדינות כדי להחזיר את החרוזים. תייגו את שמונת צינורות הרצועה בצורה מתאימה.

הוסף 0.5 מיקרוגרם כל אחד מ-H3K4me3, H3K4me1 ו-G, ו-0.6 מיקרוגרם של נוגדנים פוליקלונליים E2F7 ממקורות שונים לכל צינור תגובה. הפיפטה בעדינות לערבוב היטב את תכולת כל צינור תגובה ודגירה למשך הלילה על נוטאטור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עם פקקי צינורות מורמים. הסר את שמונת צינורות הרצועה מהנוטאטור ובצע סיבוב מהיר לאיסוף נוזלים בתחתית כל צינור.

עכשיו מניחים את הצינורות על מעמד המגנט עד שהתערובת תתפזר. לאחר מכן פיפט בזהירות כדי להסיר ולהשליך את הסופרנטנט. השאירו את הצינורות על מעמד המגנט, שטפו כל צינור פעמיים עם 200 מיקרוליטר של בופר חדירות תאים קרים והשתמשו בפיפטה מרובת ערוצים להסרת הסופרנטנט לאחר כל שטיפה.

לאחר מכן, הסר את הצינורות ממעמד המגנט. מיד הוסיפו 50 מיקרוליטר של בופר חדיר לתאים קרים לכל תגובה והפיפטה בעדינות כדי להחזיר את התאים והחרוזים. לאחר מכן מוסיפים 2.5 מיקרוליטר של חלבון AG-מיקרוקוקל נוקלאז לכל תגובה ומערבבים היטב על ידי פיפטינג עדין.

לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, יש לבצע סיבוב מהיר של הצינורות. מניחים אותם חזרה על מעמד המגנט עד שהתערובת תתפזר, ואז הסר את הסופרנטנט. לאחר שטיפת החרוזים פעמיים עם בופר חדירות תא קר, החזירו אותם בעדינות ל-50 מיקרוליטר של בופר חדיר לתא.

בעת שמירה על הצינורות על קרח, הוסף מיקרוליטר אחד של סידן כלוריד 100 מילימולר לכל תגובה ברצועת שמונה הצינורות מהשלב הקודם. פיפטה עדינה כדי לתלות את החרוזים במלואם ולקדם עיכול יעיל. דגרו את הצינורות על נוטאטור בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים, תוך שמירה על פקקי הצינורות מוגבהים לאורך כל הדגירה.

כעת בצינור חדש בנפח 1.5 מיליליטר, יש להכין את תערובת העצירה על ידי שילוב של 33 מיקרוליטר של בופר עצירה עם מיקרוליטר אחד של זינוק Escherichia coli ב-DNA ב-0.5 ננוגרם לכל תגובה. מערבב עדין כדי לערבב את התמיסה. בסיום הדגירה של שעתיים, הוסיפו 33 מיקרוליטר מתערובת העצירה המוכנה לכל צינור תגובה וערבבו היטב.

דגרו את צינורות התגובה בתרמחזור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר סיבוב מהיר, מניחים את הצינורות על מתקן מגנט עד שהתמיסה מתבהרת. העבר בזהירות כ-85 מיקרוליטר של הסופרנטנט המכיל את ה-CUT&RUN לשחרור DNA לשחרור לצינורות טריים בנפח 1.5 מיליליטר.

לטהר את ה-DNA שהוחזר, להעריך את כמותו, ולבצע פיזור גודל מקטעים לבקרת איכות. לאחר מכן המשיכו בהכנת ספריית CUT&RUN, כמות, איגוד ספריות מאונדקס, ורצף מהדור הבא בזוגות. קווי תאים גבוהים בהומולוג-1 של אצ'אט-סקואט, DMS79 ו-H146, וקווי תאים בעלי מקדם התמיינות נוירוגנית 1, H82 גדלו כאגרגטים לא דביקים או כספרואידים קומפקטיים בהשעיה, בעוד ש-H446 הציג מורפולוגיה מעורבת, עם כ-80% תאים מולדים ו-20% בהשעיה.

ניתוח קטעי DNA של CUT&RUN גילה כי סימן ההיסטון המגבר H3K4me1 הניב את הכמויות הגבוהות ביותר ב-DNA בכל קווי התאים, ואחריו H3K4me3, כאשר E2F7 ו-IgG הניבו את הכמויות הנמוכות ביותר. עבור DNA CUT&RUN שהופק, התפלגות גודל המקטעים עבור H3K4me1 ו-H3K4me3 הראתה שיאים ברורים למונוקלאוזום ודי-נוקלאוזום יחד עם DNA גנומי. לעומת זאת, לא זוהו שיאים מובחנים עבור E2F7 או בקרת IgG.

למרות קלט DNA נמוך, ספריות ריצוף מהדור הבא נבנו בהצלחה לכל יעדי CUT&RUN, כולל E2F7 ו-IgG. ניתוח מפת חום בתאי DMS79 wild type ו-H146 הטרוזיגוטיים הראה שאותות H3K4me3 ו-E2F7 הועשרו בקרבת אתרי התחלת השעתוק, בעוד שאותות H3K4me1 היו מפוזרים באופן רחב יותר. הדמיית דפדפן הגנום באזור כרומטין שנבחר באקראי הראתה שיאים מובחנים ל-H3K4me3, H3K4me1 ו-E2F7, בעוד ש-IgG לא הראה העשרה.

ולכן, באופן מסורתי, מדענים וחוקרים השתמשו באימונופרציפיטציה של כרומטין ואחריה בריצוף או ChIP-seq כדי לענות על שאלות כמו אלו שאנו שואלים. עם זאת, ChIP-seq דורש כמות גבוהה יחסית של חומרי קלט, מה שלא תמיד אפשרי, תלוי באיזה דגם בו משתמשים. CUT&RUN, לעומת זאת, דורש הרבה פחות חומר קלט, נמוך עד 50,000 תאים, ודורש פחות קריאות רצף בתפוקה גבוהה, מה שאומר שהוא זול יותר, ומייצר הרבה פחות רקע ביצירת נתונים.

CUT&RUN היא טכניקה שניתן ליישם לא רק על תאים בתרבות דו-ממדית, אלא גם למודלים פרה-קליניים אחרים, כמו אורגנידים שמקורם במטופלים וקסנוגרפטים. ניתן להשתמש בו גם לפרופיל נוף הכרומטין ברקמות, כולל רקמות תקינות וחולה. זו טכנולוגיה או טכניקה שימושית מאוד לחוקרי סרטן, אך יכולה להיות מאוד שימושית גם לחוקרים שאינם סרטניים המתמקדים בחקר מחלות אנושיות שונות.

פרוטוקול זה מאפשר מיפוי של שינויים בהיסטונים ושל הפרופילים הקבועים של החלבונים המגוונים במקום בגנום התאי. אספקת PTMs היסטונים וקישור TF בין תת-סוגי SCLC עשויים לחשוף גנים ואלמנטים רגולטוריים ייחודיים לתת-סוג, כגון משפרים ומגבירי על.