ניתוח DNA מיקרוביאלי בשטח באמצעות ערכת שדה חילוץ ביולוגית ויחידת qPCR שדה

היקף המחקר שלנו באמת כולל ביצוע ניתוח מולקולרי שנוכל להשתמש בו כדי לאפיין מיקרובים המעורבים בשיקום, כרייה, מניעת קורוזיה, ועוזר לנו לענות על שאלות לגבי קיימות. מחקר זה מתמודד עם מספר פערי מחקר ונגישות באמצעות זרימות עבודה מולקולריות ביולוגיות אמינות וניידות לשטח, שהן פשוטות לשימוש. פתח את שני קצות המסנן וחבר מזרק של שלושה מיליליטר מלא באוויר למסנן באמצעות חיבור הלואר הנעיל.

דחוף את האוויר פנימה כדי להוציא מים שנותרו. נתק את המזרק ושאב עוד אוויר לפני שתחזור על הפעולה. אחר כך, תחזיר את מכסה השקע האדום.

הפוך את התמיסה עם מזרק לערבוב. הסר את פקק מזרק הנעילה של Luer וחבר את מזרק Solution A לכניסת פילטר 0.2 מיקרומטר דרך קצה הנעילה של Luer. לחץ על הבוכנה כדי להוסיף לאט את התמיסה A. לאחר מכן, נער בחוזקה את המסנן הסגור במשך חמש דקות.

עכשיו, הפוך את מזרק תמיסה B כמה פעמים כדי לערבב. הסר את מכסה הנעילה של Luer וחבר את המזרק לכניסת המסנן המכוסה דרך קצה הנעילה של Luer. לאחר סגירת מכסה המסנן של הכניסה, נער בחוזקה את המסנן הסגור בחוזקה במשך חמש דקות.

הסר את מכסה הכניסה והפך את המסנן. השתמש במזרק של שלושה מיליליטר שמחובר ליחידת המסנן המכוסה כדי לדחוף מיליליטר אוויר אחד לתוך המסנן. לאחר מכן, משוך את הבוכנה לאחור כדי להסיר את כל הליזאט.

העבר את הליזאט לצינור חרוזים בנפח חמישה מיליליטר. לאחר איטום עם פארפילם, נער בחוזקה את צינור החרוזים בחוזקה במשך חמש דקות לפני שמניחים אותו זקוף. הנח את מחסנית ההכנה של הדגימה על משטח שטוח וחבר עמוד Luer נעילה למזרק של מיליליטר אחד.

השתמשו בקצה המחודד של העמוד כדי לחדור שני חורים בחלק הראשון של מחסנית ההכנה לדגימה. פיפט מיליליטר אחד של ליזאט מצינור החרוזים אל החור החדש שננקב לחלק הראשון של המחסנית. הכנס את עמודת המזרק חזרה לחלק האדום של המחסנית.

אחר כך, משוך את הנוזל לגמרי לתוך המזרק ואז דוחף אותו החוצה 10 פעמים. כעת, מקם את קצה עמוד המזרק המחודד מעל החלק האדום-כתום וחורר שני חורים במחסום האלומיניום. באמצעות הבוכנה, משוך את כל נפח הנוזל של המזרק לתוך המזרק ומשאב את הנוזל החוצה לחלוטין.

באופן דומה, השתמש בעמודת המזרקים כדי לנקב ולשאוב את החלקים הכתום, הצהוב, הכחול, היבש באוויר והירוק, תוך משיכה ודחיפה של הבוכנה מספר הפעמים שצוינו בקטע. לאחר מכן, השתמשו במזרק של מיליליטר אחד ובעמודת הכנת הדגימה כדי להעביר את כל התמיסה מהחלק הירוק למיקרוצינור מתויג היטב בנפח מיליליטר. הניחו עד שלוש דגימות DNA שהופקו מהשדה במגש הדגימה הטהור של מכשיר qPCR מבוסס שדה, כדי להבטיח דגימה אחת לכל חלק ייעודי.

הניחו את רצועות הבדיקה לכל דגימה בחריצי רצועות A, B או C המתאימים על המגש, תוך יישור הבאר הראשונה של כל רצועה עם החריץ הראשון במגש. פתח את הטלפון ופתח את האפליקציה שנקראת על שם מכשיר qPCR המסחרי. כאשר האפליקציה נפתחת, הקש על כפתור Start Run.

במסך הבא, הקש על כפתור יצירת מזהים. הזן מידע לדוגמה על ידי לחיצה תחת מזהה דגימה והקלדת שם המדגם. הקש על יחידות הדגימה ובחר את היחידה המתאימה, ואז לחץ מתחת לכמות הדגימה והזן את הנפח ששימש במהלך החילוץ.

לאחר הזנת מידע לכל הדגימות, הקש על כפתור ההמשך. במסך הבא, הקש על אייקון התיקייה ואז לחץ על שמור לתיקייה הנוכחית. הקלד שם ריצה והקש על אישור.

הדליק את המכשיר על ידי לחיצה והחזקה על כפתור ההפעלה עד שכל האורות הקדמיים נדלקו. הקש על אישור בבקשה כדי להמשיך. לחץ על חיבור דרך אלחוטי לטווח קצר משולב באפליקציה.

לחצו על כפתור האלחוטי המשולב לטווח קצר במכשיר עד שהאור הכחול מהבהב. לאחר מכן הקש על אישור ובחר את שם הכלי כדי להתחבר. הסר את הפקקים מצינורות הגו סטריפ לדגימה הראשונה.

הוסף 18 מיקרוליטר מים סטריליים לכל באר והשתמש בפיפט עדין כדי להמיס את הכדור. הוסף שני מיקרוליטרים של דגימה לכל באר ואטום את הצינורות עם פקקי רצועות בדיקה מגומי, כדי להבטיח כיוון נכון. הקש על אישור באפליקציה לאחר שכל הרצועות מוכנות.

הסר כל רצועת בדיקה. בדוק אם יש בועות בתחתית הבארות, ואז נענע בעדינות את הרצועה עד שהבועות עולות. הקש על אישור כדי להמשיך.

פתח את מכסה המכשיר ומניח את רצועות הבדיקה בתוך המכשיר בסדר ובכיוון הנכונים. סגור את המכסה עד שהוא ננעל, והקש על אישור. הקש על כפתור Start Run באפליקציה כדי להתחיל את הריצה.

כשהריצה מסתיימת, הקש על שליחת תוצאות. לאחר החיבור לאינטרנט אלחוטי, יש ללחוץ על שלח שוב כדי לשדר תוצאות. נקה את המגש היטב בין הרצפות כדי למנוע זיהום.

השלמת בידוד DNA מוצלחת באמצעות ערכת שדה החילוץ הביולוגית אושרה על ידי תוצאות qPCR עקביות בהשוואה לשיטה מבוססת מעבדה מאומתת. דילול תרבית סטנדרטי של דהלוקוקואידים שנותח באמצעות יחידת qPCR מבוססת שדה הראה סטייה נמוכה ב-10 חזרות בשני הטמפרטורות של 21 מעלות צלזיוס ו-30 מעלות צלזיוס. בדיקות מדויקות של מכשירי השטח הראו סטיית תקן יחסית מתחת ל-5% בכל המסלולים.

אז הממצאים שלנו באמת מקדמים את התחום בכך שהם מאפשרים ניטור סביבתי במקומות מרוחקים אלה, וזה באמת מטפח את הנגישות, המעורבות הקהילתית ויוצר מחקר מדעי בעל השפעה רבה. התוצאות שלנו סללו את הדרך להבנת האופן שבו דגימות משתנות במהלך המשלוח לעומת חילוץ וניתוח מיידי. המחקר העתידי יתמקד בהגדרת גבולות השיטות הללו עבור דגימות קיצוניות כמו מי מלח, וכן לתנאי מזג אוויר קיצוניים.