פלטפורמה חדשנית למתיחות והדמיה תאית חובנית
10 במרץ 2026
כאן אנו מציגים מכשיר חדשני שמיישם גלי עיוות איזוטרופיים וחד-ציריים על תאים, תוך תמיכה בתרבות על תת-קרקעיות עם קשיחות מכווננת ומטריצות חלבון מותאמת אישית. פלטפורמה פשוטה וחסכונית זו מאפשרת לחוקרים לחקור כיצד רמזים מכניים מווסתים את תפקוד התאים הן במחקרים בסיסיים והן בהקשרים רלוונטיים למחלות.
מטרתנו הייתה לפתח מכשיר מתיחה תאים תואם מיקרוסקופ בהשראת הוברמן בעלות נמוכה, כדי לחקור כיצד מתיחה מכנית משפיעה על תפקוד התאים. מכשיר זה מאפשר לחוקרים לחקור את תגובות תאי החיים לגירויים מכניים, תוך חיקוי מערכות פיזיולוגיות כמו לב פועם או ריאות נושמות. להתחיל כאשר ציוד מגן אישי מתאים.
מערבבים בסיס סילגארד 184 עם חומר ייבוש ביחס של 10 לאחד בצלחת פלסטיק. עם מדכא לשון מערבבים את הרכיבים בעוצמה במשך שתי עד שלוש דקות. לאחר מכן מניחים את המנה בתא ניקוי גזים למשך שעה.
לאחר מכן, קחו את התבניות המוכנות במודפסות תלת-ממדיות והוסיפו 1.3 גרם מתערובת PDMS לתבנית האיזוטרופית. לאחר מכן מוסיפים 0.5 גרם מתערובת PDMS לתבנית החד-צירית. פזר את הג'ל באופן שווה על פני התבנית והוציא גזים מהתבנית המלאה למשך שעה.
תנו לג'ל בתבנית להתייצב על משטח שטוח בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר מכן מקבשים את התבנית בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, מערבבים חלקים A ו-B של ג'ל NuSil 8100 ביחס שווה.
מערבבים את הג'ל המשולב עם צולב סילגארד 184 ב-0.36% מהנפח הכולל ליצירת קשיחות של 13 קילופסקל. כדי לייצר מצע רך עם קשיחות של 0.3 קילופסקל, דלג על הוספת הקרוסלינקר, ואז ערבב את התמיסה בגלגול במשך 15 דקות. הנח את תערובת NuSil בתא הסרת גזים והסרת גזים למשך 30 דקות.
עכשיו הסר בזהירות את ג'ל ה-PDMS מהתבנית המותאמת והנח אותו על כיסוי 40 מ"מ מבלי לקרוע אותו. לאחר מכן שים את ג'ל ה-PDMS במקודד הספין. פיפט 100 מיקרוליטרים מתערובת NuSil על השטח השלילי של ג'ל PDMS האיזוטרופי.
לאחר מכן פיפטה של 50 מיקרוליטר מתערובת NuSil על השטח השלילי של ג'ל PDMS חד-צירי. אחרי הקוד הזה ב-7 G למשך 50 שניות. כדי להגיע לעובי של 100 מיקרומטר.
תן לג'ל המצופה להתייצב על משטח שטוח בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. הכניסו את הג'ל לתנור והתקבשו ב-60 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. כעת זרעו את דרכי הנשימה האנושיות, תאי שריר חלק בבארות תרבית תאים אלסטיים ודגרו בתנאים סטנדרטיים.
לאחר מכן, מערבבים תאים עם תמיסת FLIPR Calcium 6 להדמיה. למדידת כוח האחיזה, ציפו את מצעי הג'ל של PDMS NuSil בשכבת חרוזים פלואורסצנטיים שישמשו כסמנים פידוציאליים. הכן תמיסה של 0.025% בקוטר מיקרומטר אחד של מיקרוספירות קרבוקסילצנטיות אדומות שעברו עיבוד ב-HBSS.
באמצעות מערבל מערבל, מערבל את תמיסת החרוזים למשך 10 שניות. לאחר מכן פיפטה של 880 מיקרוליטר של תמיסת החרוזים לג'ל האיזוטרופי. הוסיפו 420 מיקרוליטר של תמיסת החרוזים לג'ל החד-צירי.
לאחר דגירה של הג'ל בטמפרטורת החדר למשך שעה, הסר בזהירות את תמיסת החרוזים כדי לשמור על התפלגות החרוזים. לאחר מכן השתמשו במגבון כותנה או מגבון מעבדה כדי למרוח בעדינות שאריות תמיסה מהג'ל. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמה, מנוע אור ואובייקטיב יבש של 10x.
כוון את ההתרגשות ל-475 על 40 ננומטר ואת הפליטה ל-555 על 50 ננומטר. לרכוש תמונות של 16 ביט בקצב פריימים של שני הרץ במהלך ניסויי מתיחה. כעת הנח ג'ל איזוטרופי על המתיחה ואז צילם את החרוזים הפלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד ב-10x אובייקטיב יבש. לצלם תמונות במצב לפני המתיחה.
לצלם תמונות באופן רציף לאורך פרוטוקול המתיחה במרכז המצע. למקד מחדש את המיקרוסקופ במצב המתוח במידת הצורך לפני צילום התמונות. נתח את התמונות באמצעות קוד MATLAB מותאם אישית המבוסס על מיקרוסקופיית כוח אחיזה פורייה כדי לחשב וקטורי תזוזה ושדות עיוות מישוריים מתאימים.
ייצג את הנתונים כממוצע של ניסויים סופיים. החלת תזוזה של 240 מיקרומטר גרמה לחרוזי פלואורסצנט לזוז רדיאלית החוצה מהמרכז. מיקרוסקופ כוח הגרירה גילה שדה הזזה איזוטרופי עם וקטורים הפולטים החוצה מהמרכז וגדלים בעוצמה עם המרחק.
שדה ההזזה האיזוטרופי יצר שדה עיוות מישורי הומוגני. הגדלת ההעתקה ל-1000 מיקרומטר יצרה וקטורי תזוזה שגדלו בעוצמה תוך שמירה על אוריינטציה רדיאלית. שדה העיוות המתאים ב-1000 מיקרומטר גדל בעוצמה תוך שמירה על סימטריה רדיאלית.
בג'לים חד-ציריים שעברו תזוזה של 250 מיקרומטר, וקטורי ההזזה היו מיושרים בעיקר לאורך ציר יחיד, בהתאם למאמץ חד-צירי. גלי המתח שיקפו במידה רבה את תזוזוקת המנועים המתוכנתת ונשארו מסונכרנים בשלושה מחזורים חוזרים. ערכי העיוות בתזוזה מקסימלית נשארו עקביים בשלושה דגימות עצמאיות.
החלת תזוזה חולפת עד 5,555 מיקרומטרים יצרה זנים הנעים בין יותר מ-0.1% ל-12%A עווות חולף של 0.5% גרם לעלייה בסידן התוך-תאי, כפי שניכר בעוצמת פלואורסצנציה גבוהה יותר לאחר מתיחה. באמצעות האלונקה שלנו, חוקרים יכולים לבצע הדמיית סידן של תאים חיים, מיקרוסקופיית כוח אחיזה, וכימות תגובות מכניות תאיות למתיחה איזוטרופית או חד-צירית. שלב קריטי הוא להבטיח שהג'לים יתייבשו על משטח ישר, שכן עובי לא אחיד עלול להזיז את המצע מהפוקוס ולהפחית את הבהירות האופטית במהלך הדמיה חיה.
מחקרים עתידיים יוכלו לחקור שינוי כיוון ציטוסקלטלי שנגרם ממתיחה, מצבים פתולוגיים של עומס רלוונטי לאסתמה או פגיעת ריאות, ובין סוגי תאים מגוונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג את הפיתוח והיישום של מכשיר למתיחת תאים בעלות נמוכה, התואם למיקרוסקופ, בהשראת מנגנון הובֶרמן (Hoberman). המכשיר מאפשר לחוקרים להפעיל מאמץ מכני איזוטרופי או חד-צירי מבוקר על תאים נצמדים המגודלים על מצעים אלסטומריים בעלי קשיחות ניתנת לכיוונון, ובכך מקל על דימיון חי ואנליזה כמותית של תגובות תאיות לרמזים מכניים. הפלטפורמה מודגמת באמצעות תאי שריר חלק ראשוניים ממסכת האוויר של בני אדם, עם מדידות של דינמיקת סידן תוך-תאית וכוחות משיכה של תאים תחת מתיחה מכנית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביומכניקה תאית
- מכננו-ביולוגיה
- הנדסה ביו-רפואית
רקע
- תאים חשים ומגיבים לרמזים מכניים, כגון קשיחות של המטריצה החוץ-תאית (ECM) ומתיחה מחזורית.
- כוחות מכניים מווסתים תהליכים כגון גורל התא, תקשורת והתפתחות.
- סביבות מכניות משתנות תורמות למחלות הכוללות אסתמה, יתר לחץ דם וסרטן.
- מכשירי מתיחה קיימים במעבדה (in vitro) חסרים לעיתים קרובות רלוונטיות פיזיולוגית או תאימות לדימות של תאים חיים.
מטרת המחקר
- פיתוח מכשיר מתיחה קומפקטי, חסכוני ותואם למיקרוסקופ עבור מחקרי תאים חיים.
- מתן אפשרות להפעלת מאמץ איזוטרופי או חד-צירי מבוקר על תאים המונחים על מצעים בעלי קשיחות ניתנת לכיוונון.
- סיוע בביצוע ניתוח כמותי של תגובות תאיות למתיחה מכנית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור של צלחות תרבית אלסטומריות מבוססות PDMS ו-NuSil בעלות קשיחות ניתנת לכיוונון (0.3–13 kPa).
- ציפוי מצעים בחלבוני מטריקס ובחרוזים פלואורסצנטיים לצורך היצמדות תאים ומיקרוסקופיית כוחות מתיחה (traction force microscopy).
- זריעה של תאי שריר חלק ראשוניים מדרכי הנשימה של בני אדם וביצוע דימות סידן של תאים חיים באמצעות FLIPR Calcium 6.
- הפעלת מתיחה מכנית תכנונית באמצעות התקן המונע על ידי מנוע פסיעות, תוך דימוי וניתוח באמצעות קוד MATLAB ייעודי לכימות כוחות מתיחה ושדה מאמץ (strain field).
תוצאות עיקריות
- המכשיר יצר שדות מאמץ איזוטרופיים וחד-צירים מבוקרים, אשר תוקפו באמצעות מיפוי תזוזה ומאמץ של חרוזי פלואורסצנציה.
- צורות גל המאמץ תאמו באופן הדוק את תזוזות המנוע המתוכננות והיו ניתנות לשחזור בין דגימות שונות.
- מתיחה מכנית גרמה לעלייה מדידה בריכוז הסידן התוך-תאי בתאי שריר חלק של דרכי הנשימה.
- מיקרוסקופיית כוחות משיכה (Traction force microscopy) חשפה שדות מאמץ מישוריים הומוגניים תחת מתיחה איזוטרופית ותזוזה המיושרת לציר תחת מתיחה חד-צירית.
מסקנות
- המתיח שפותח מאפשר מחקרים מדויקים של תאים חיים לבחינת תגובות מכניות בתנאים רלוונטיים פיזיולוגית.
- הוא תומך בוויסות עצמאי של קשיחות התשתית והרכב ה-ECM.
- פלטפורמה זו רב-גונית לחקר מכנו-טרנסדוקציה (mechanotransduction) במצב בריאות ובמחלה, וניתן להתאימה לסוגי תאים מגוונים ולמודלים פתולוגיים של מאמץ (strain).
שאלות נשאלות שכיחות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מכנטרנסדוקציה (Mechanotransduction) היא ציר קריטי במידול מחלות ובתיקוף מטרות, אך רוב המערכות במעבדה (in vitro) חסרות רלוונטיות פיזיולוגית או דיוק כמותי. פלטפורמה זו מאפשרת גירוי מכני ניתן לתכנות ובעל רלוונטיות פיזיולוגית של תאים נצמדים, בשילוב עם דימות חי ותוצרי קריאה כמותיים, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בשלבי גילוי מוקדמים ובמחקרים טרנסלציונליים. המודולריות וההדירות שלה ממצבות אותה כיכולת הניתנת לשימוש חוזר להפחתת סיכונים מכניסטיים ולסננון תיקי פיתוח במחקר ופיתוח של ביו-פארמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מסלולים רגישים למכאנו-גירויים ותגובות תאיות תחת תנאי מאמץ מבוקרים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי כימות דינמיקת סידן תוך-תאית וכוחות משיכה.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מידול סביבות מכניות הרלוונטיות למחלה.
- מספק ביטחון תחזיתי עבור מטרות של מכנו-טרנסדוקציה בהקשרים של מחלות מורכבות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין מצעים עם קשיות ניתנת לכיוון ומאומתים עבור תהליכי סריקת תרכובות בהמשך השלבים.
- מנרמל פרוטוקולים של גרייה מכנית לקבלת תוצאים כמותיים הניתנים לשחזור.
- מאפשר דימוי חי בעל תוכן גבוה וקריאות רב-ערוציות (multiplexed) במהלך הפרעה מכנית.
- תומך בפיתוח בדיקות (assays) ניתנות להרחבה עבור סריקות פנוטיפיות מונעות ממכנוביולוגיה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה גירויים מכניים in vitro לתנאי מאמץ רלוונטיים למחלה לצורך רצף תרגומי.
- מאפשרת קבלת החלטות על קידום מבוסס התאמת סיכונים באמצעות כימות הסתגלות תאית למאמץ פתולוגי.
- תומכת בגילוי סממנים ביולוגיים על ידי קישור קלטים מכניים לפלטים תאיים תפקודיים.
- מסייעת בהפחתת סיכונים מנגנונית בבחירה ובתיקוף של מודלים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
פלטפורמה זו מגשרת בין גילוי מוקדם, פיתוח בדיקות ומחקר תרגומי על ידי אפשור מחקרים של מכנו-טרנסדוקציה המונחים בהשערות עם פלטים כמותיים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות על מסלולים רגישים למכניקה (mechanosensitive) והחלטות גורל תאי תחת מאמץ ניתן לתכנות.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור להערכת תרכובות במערכות דינמיות מכנית.
- אנליטיקה: מספק מדידות של העתקה, מאמץ ודינמיקה של סידן להשוואה איתנה בין תנאים.
- מחקר טרנסלציונלי: ממדל סביבות מכניות רלוונטיות למחלה כדי לספק מידע עבור תיקוף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע מערכת מודולרית התואמת למיקרוסקופ וניתנת להתאמה לסוגי תאים ומודלים של מחלות שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרה.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של זרימות העבודה של גירוי מכני והדמיה לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ויעילות הון על ידי הפחתת סיכונים במטרות של תהליכי מכנו-טרנסדוקציה בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תוכניות מונעות מכנו-ביולוגיה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדימות תאים חיים, מכנו-ביולוגיה וניתוח תמונות כמותי.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיית פלואורסצנציה הפוכה ותוכנה אנליטית ייעודית (למשל, MATLAB).
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת התשתית והסטימולציה המכנית.
- ניתן להתאימה לסוגי תאים שונים ולהרכבי ECM שונים עם קשיחות תשתית ניתנת לכיוונון.
- עובי ג'ל אחיד ובהירות אופטית הם קריטיים עבור דימות באיכות גבוהה ושלמות הנתונים.
