מודולציה תלויה בליגנד כולינרגי של קישור זרחון חמצוני בתאי נוירובלסטומה BE(2)-C עם פרי דיגיטונין

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להדגים שיטה להערכת הביואנרגטיקה המיטוכונדריאלית בתאי נוירובלסטומה מתורבתים שלמים, באמצעות שילוב פרמיאביליזציה סלקטיבית ומעכבי סובסטרטים. באופן מסורתי, הנשימה המיטוכונדריאלית מוערכת באמצעות כלים כמו הספירומטר Oroboros O2K ברזולוציה גבוהה, אלקטרודת החמצן מסוג Clark, ומנתח Seahorse XF. שיטות מסורתיות המבוססות על חלק מיטוכונדריאלי מבודד או מועשר מרקמות או תאים לעיתים קרובות פוגעות במבנה המיטוכונדריאלי.

לדוגמה, תמונת מיקרוסקופ אלקטרוני השידור הזו של מיטוכונדריה מבודדת מקורטקס העכבר מראה ניגוד ברור בשלמות המבנית, בהתאם לשאלה האם המיטוכונדריה מכוסה בטרמינלים פרה-סינפטיים או לא. מיטוכונדריה שנותרה כלואה בתוך הטרמינלים הפרה-סינפטיים נראות שלמות מבחינה מבנית, כפי שמצוין על ידי חיצי הציאן בתמונה זו. לעומת זאת, מיטוכונדריה שאינה מוקפת או חסרת מבנה ממברני מסביב נראית לעיתים מעוותת, כפי שמיוצגת על ידי החצים הצהובים.

אנלייזר Seahorse Flex משמש לעיתים קרובות לחקר ביואנרגטיקה מיטוכונדריאלית הן בתאים מתורבתים והן במיטוכונדריה מבודדת. בניתוח מבוסס תאים מתורבת, נשמרות ארכיטקטורה תאית ורשתות איתות. עם זאת, ממברנת הפלזמה של תאים שלמים אינה חדירה לרבים מהסובסטרטים במחזור חומצה טריקרבוקסילית.

דבר זה מגביל את היקף הניתוח המטבולי בהשוואה למיטוכונדריה מבודדת, שחסרה מחסום ממברנת פלזמה, אך לעיתים מציגה את הארטיפקטים המבניים. לכן, לשתי המערכות יש מגבלות מובנות. הטכניקה המוצגת כאן מנצלת את העובדה שקרום הפלזמה עשיר בכולסטרול, בעוד שהממברנה המיטוכונדריאלית מכילה מעט מאוד.

באמצעות חומר ניקוי קושר לכולסטרול כמו דיג'יטונין, ניתן לחדור באופן סלקטיביאלי לממברנת הפלזמה תוך השארת הממברנה המיטוכונדריאלית שלמה. גישה זו מאפשרת כניסה מבוקרת של סובסטרטים ומעכבים מיטוכונדריאליים לתא מבלי לפגוע בשלמות האברון. כך, טכניקה זו מאפשרת ניתוח פונקציונלי של מיטוכונדריה בהקשר של תאים שלמים, ומשלבת את היתרון של ארכיטקטורת תא שלמה עם נגישות לבדיקות מיטוכונדריה מבודדות.

התחל את הניסוי עם צלחת תרבית תת-קונפלואנטית של התאים שלך. שטפו את התאים בעדינות עם בופר זרחן סטרילי. הוסיפו נפח מתאים של תמיסת טריטון כדי לכסות באופן שווה את שכבת התא. לאחר הדגירה, הסר את הצלחת וטפח או נער בעדינות אופקית כדי לעזור לשחרר את התאים.

באמצעות פיפטה של 5 מ"ל ובקר פיפטות, הפיפטה של מתלה התא למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לפרק כל גוש ולהשיג תלייה של תא יחיד. בדוק את תליית התא תחת מיקרוסקופ כדי לאשר תלייה אחידה של תא יחיד. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.

כוון את ריכוז התא כך ש-100 מיקרוליטר מהתלייה יכילו בערך 10,000 תאים. האיץ בזהירות 100 מיקרוליטר של מתלה התא לכל באר של לוח הבדיקה Seahorse XF. השאירו אחד ריק כדי לשמש כבקרת רקע במהלך הבדיקה.

דגרו את הלוח באינקובטור תרבית תאים למשך שעתיים עד שלוש כדי לאפשר לתאים להיצמד לתחתית הבאר. לאחר שהתאים מחוברים, מוסיפים בעדינות 300 מיקרוליטר של מדיום בדיקה לכל באר. החזירו את הצלחת לאינקובטור ודגרו במשך הלילה כדי לאפשר לתאים להתייצב ולגדול.

ודא שהתאים יוצרים שכבה אחידה בתחתית כל באר. הימנע מצפיפות. התאים צריכים להיות מתאחדים, אך לא יתרוממים מדי, כדי להבטיח ביצועי בדיקה מיטביים.

בלילה שלפני הניסוי, יש להרטיב את מחסנית החיישן XFp 24 על ידי הוספת מ"ל אחד של בופר כיול לכל באר. לחלופין, אפשר להשתמש במי מלח בופר של פוספט, pH 7.4. השאירו את המחסנית בטמפרטורת החדר ללילה על המיטה.

אינקובציה באינקובטור שאינו COT בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס אינה נדרשת, שכן המחסנית תתאזן לטמפרטורת החדר במהלך תהליך הטעינה. קרא לכל התמיסות הקפואות ו-2 בופר מיקרוגליאלי בטמפרטורת החדר. בדוק את ה-pH, הוא אמור להיות 7.4.

תתאים אם צריך. הכינו את כל התת-מצע ותמיסות ההזרקה ווודאו שוב את ה-pH. תשאיר את כל התמיסות על הקרח עד השימוש.

הכינו צינורות מזון המסומנים A, B, C ו-D לפתרונות לפתח הזרקת מחסניות לחיישנים. הכי טוב לייצר תמיסות המכילים מעכבים או תת-קרקעיות מתאימים לכל פורט. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, טענו בזהירות 50 מיקרוליטר מכל תמיסת יציאת הזרקה לתוך היציאות המתאימות, מ-A ל-D.

הפעל את האנלייזר הביולוגי של Seahorse שעה עד שעתיים לפני הניסוי כדי לאפשר לאינקובטור הפנימי להתייצב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. תייג כל באר, ותקבץ לפי עיצוב הניסוי שלך והנחיות Wave Desktop 2.6. תכנתו את הביואנלייזר לתערובת, משקל ומחזור המדידה המתאימים.

ראו טבלה 8 לעיון. חשוב לבטל את אפשרות האיזון בתחילת מחזור המדידה. השארת השיער תאריך את הניסוי באופן מיותר ועלולה לרוקן את המצעים.

הפעל את המכונה תכייל תחילה את מחסנית החיישן, מה שלוקח כ-15 דקות. התחילו להכין את פלטת התא מיד לאחר הכנסת מחסנית החיישן לכיול. שאפו בזהירות את הבופר מבלי להפריע לתאים בכמות של כ-700 מיקרוליטר של בופר מיטוכונדריאלי של 1x לכל באר עם תאים דבוקים, והניחו לפלטה לשבת דקה אחת לאיזון.

שאפו בזהירות את הבופר מכל באר מבלי להפריע לתאים הדביקים. חזור על שלב הכביסה שלוש פעמים כדי להבטיח מדיום מלא. במקביל, הוסיפו 50 מיקרוליטר של בופר בדיקה מיטוכונדריאלי לבאר רקע ללא תאים.

השתמש במניסקוס כנקודת ייחוס ויזואלית לעקביות בנפח. שאפו בזהירות את הבופר מהבארות המכילות תא, והשאירו כ-50 מיקרוליטר לשמירה על הידרציה של התא. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, בין אם באמבט מים, תוך שמירה מעל פני המים או בדוגמה שאינה פלדה עם האטמוספירה הרוויה כדי למנוע אידוי.

רגע לפני הטעינה לאנלייזר, הוסף 450 מיקרוליטר של בופר בדיקה מיטוכונדריאלי מחומם מראש המכיל סובסטרטים, מעכבים או תרופות לפי הצורך לכל באר, מה שמביא את הנפח הכולל ל-500 מיקרוליטר. הפלטה מוכנה כעת להריץ את הבדיקה באמצעות מחסנית החיישן המכויל בביואנלייזר Seahorse. ראשית, אנו מבצעים בדיקת קישור כדי לבחון את מידת הקישור בין מערכת העברת האלקטרונים לבין פוספורילציה חמצנית.

מבחן הקישור מעניק להבחין בין תפקוד מיטוכונדריה לתפקוד לקויה. בדיאגרמה זו של מערכת העברת האלקטרונים המיטוכונדריאלית, אנו מציגים מעכבים ספציפיים מורכבים אחד, שלושה וחמישה יחד עם הצמתים של תת-קרקעים שונים כמו פירובט או מלאט וסוקסינט, האלקטרונים תורמים למערכת. הדמיה זו שימושית להבנת אופן פעולת המבחן ותפקידם של סובסטרטים ומעכבים שונים.

ראשית בוחנים שני ריכוזים שונים של דיגיטונין, חמישה מיקרומולריים ו-10 מיקרומולר, ליעילותם בהקלה על העברת אלקטרונים דרך ממברנת הפלזמה ובאפשרות בדיקת הקישור. במבחן זה, רמת הקישור הנשימתי הוערכה על ידי מדידת קצב צריכת חמצן ברצף בנוכחות סוקינאט כסובסטרט, ורוטנון כמעכב מורכב אחד. ADP, אוליגומיצין, FCCP ואנטימיצין A הוזרקו ברצף, ומדידות OCR נרשמו לאחר כל הזרקה.

הפאנל השמאלי מציג גרפים קוויים המתארים את הקינטיקה של מתח החמצן בתוך המיקרו-תא החולף. בדרך כלל, ערך זה צריך להישאר בין 100 ל-200 מילימטר כספית כדי להבטיח זיהוי בטווח הדינמי של החיישן. מערכי נתונים אלו נוצרו באמצעות מצב נקודה לנקודה בתוכנת Agilent Wave, המציגה OCR כסדרה של קצבים לאורך תקופת המדידה, ומאפשרת ויזואליזציה של שינויים דינמיים, במיוחד 10 מיקרומולר דיגיטונין שהגביר את העברת הסוקסינט לעומת חמישה מיקרומולר, מה שמוביל למתח חמצן נמוך יותר במיקרו תא, ובהתאם, קליטת חמצן גבוהה יותר.

הצגת הנתונים שנאספו מניסויים אלו חשפו כי הנשימה הבסיסית המתווכת על ידי קומפלקסים שתיים עד ארבע הייתה גבוהה משמעותית ב-10 דיגיטונין מיקרומולר לעומת חמישה מיקרומולר, מה שמעיד על העברה סוקסינאט יעילה יותר דרך ממברנת הפלזמה החדירה בריכוז גבוה יותר. בהתבסס על תצפית זו, ובהינתן ש-10 דיגיטונין מיקרומולריים סיפקו חדירות אופטימלית, הורדנו לאחר מכן את מספר התאים ל-20,000 תאים לטובת הנשימה הבסיסית הנמוכה. התאמה זו הבטיחה שכל שיפור נשימתי שנגרם על ידי תרופות או מצע יישאר בטווח הגילוי הדינמי של המערכת.

לאחר שריכוז הדיג'טונין ומספר התאים היו אופטימליים, נערך מבחן הקישור הבא להערכת השפעות האגוניסטים והאנטגוניסטים המוסקריניים על הנשימה המיטוכונדרית. ממצא חשוב מקבוצת ניסויים זו היה שבתאים דיגיטונין שלא טופלו, הנשימה הבסיסית המתווכת על ידי קומפלקסים מונעי סוקסנאט שתיים עד ארבעה, וכן הנשימה במצב 3 ומצב 3u הופחתה משמעותית. דבר זה מצביע על כך שסוקסינאט לא הועבר לתא בתנאים שאינם חדירים.

הצגת הנתונים מניסויים עצמאיים רבים הראתה כי האנטגוניסט המוסקריני אטרופין הפחית משמעותית את הנשימה הבסיסית המתווכת על ידי קומפלקסים שתיים עד ארבע בתא הנוירובלסטומה בהשוואה לאגוניסט המוסקריני אצטילכולין, ששמר על רמת נשימה גבוהה. יתרה מזאת, גם הנשימה במצב 3 וגם במצב 3u הייתה נמוכה משמעותית בתאים לא חדירים מאשר בתאים חדירים, מה שמדגיש את יעילות הדיגיטונין בחדירות סלקטיבית של ממברנת הפלזמה מבלי לפגוע בתפקוד המיטוכונדריה. מבחן זרימת האלקטרונים מעריך את ההעברה הסדרתית של אלקטרונים לשרשרת העברת האלקטרונים המיטוכונדריאלית, ומסייע בזיהוי מנגנוני תפקוד לקוי או מודולציה של מיטוכונדריה.

בשלב הראשוני של הבדיקה, התאים טופלו בפירובאט, מלאט ו-FCCP, שגרמו לרמת נשימה לא מחוברת גבוהה המונעת על ידי קומפלקסים אחד עד ארבע. הוספת רוטנון לאחר מכן עיכבה את קומפלקס אחד, הפחיתה את הנשימה הבסיסית ובודדה פעילות של קומפלקס שניים עד ארבע. למרות שלא ראינו הבדלים משמעותיים בין מצבים שטופלו בתרופות לבין הביקורת, תצפית חשובה אחת הייתה כי הנשימה המונעת על ידי סוקסינאט במצב 3u הייתה נמוכה משמעותית בתאים שאינם חדירים, מה שמעיד על התפקיד הקריטי של הדיג'יטונין המאפשר כניסת סוקסינאט לתא.

לסיכום, פרוטוקול זה מציע דרך אמינה לחקור ביואנרגטיקה של מיטוכונדריה. הוא משלב את הרלוונטיות הפיזיולוגית של ארכיטקטורת התא השלמה עם דיוק של בדיקות מיטוכונדריה מבודדות, ומאפשר משלוח מבוקר של תת-קרקעי ומעכבים תוך שמירה על שלמות האברון. על ידי אופטימיזציה של ריכוז הדיגטונין וצפיפות התאים, חוקרים יכולים להשיג מדידות מדויקות וניתנות לשחזור.

גישה גמישה זו אידיאלית לחקר ויסות תפקוד מיטוכונדריה בתיווך קולטנים ומספקת פלטפורמה עוצמתית למחקר מחלות ולגילוי תרופות.