פרופיל נגישות כרומטין בזחלים שלמים של Caenorhabditis elegans L4
17 באפריל 2026
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ATAC-seq מהיר ופשוט שיושם בתולעת שלמה בשלב L4 Caenorhabditis elegans באמצעות 30 מיקרו-ליטר של כדור תולעת בלבד.
המחקר שלנו מתמקד באופן שבו ויסות אפיגנטי מעוצב על ידי ביטוי הגנים, במיוחד כיצד נגישות כרומטין שולטת בפעילות הגנים בתנאים ביולוגיים שונים. ATAC-seq ב-C.elegans מוגבל על ידי החיפוי המגן שלו. הפרוטוקולים שלנו מתגברים על מחסום זה כדי לאפשר ניתוח אמין של נגישות כרומטין.
כדי להתחיל, השג אוכלוסייה סינכרונית של תולעי L1 ואפשר להם לגדול במשך 26 שעות ב-20 מעלות צלזיוס. ודא תחת מיקרוסקופ שרוב התולעים נמצאות בשלב L4. שחזר את כל התולעים מן הצלחות עם מאגר M9 והעביר אותן לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.
שטוף את התולעים חמש פעמים עם מיליליטר אחד של מים סטריליים על ידי לתת להן להתיישב בכבידה. לאחר מכן, העבר את הצינור המכיל את התולעים לחממה של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להסיר את שרידי המזון במעיים. לאחר מכן קח 50 מיקרוליטר מהגלולה של התולעים והניח אותה בצינור חדש.
כדי לפרק את התולעים, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר SDS-DTT טרי ולשלב ברוטטור צינור במשך חמש דקות בדיוק. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מאגר ביצה קר. לאחר מכן, סובב בפיקופוג להוצאת הנוזל העליון וחזור על הפעולה שש פעמים.
לאחר מכן, הוסף 80 מיקרוליטר של פרונים טריים. באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר עם קצות מסוננות, ערבב את תערובת התולעים והפרונים 70 פעמים והשאיר אותה להתבשל בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הוסף 800 מיקרוליטר של מדיום L15 עם 10% סרום בקר עובר וצנטריפוג ב-500G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הסרת הנוזל העליון, הוסף מיליליטר אחד של מדיום L15 עם 10% סרום בקר עובר וצנטריפוג כפי שהוצג קודם לכן. לאחר שהגלולה נשטפה שלוש פעמים, הסר את הנוזל העליון והשעה מחדש את הגלולה ב-900 מיקרוליטר של מדיום L15 עם 10% סרום בקר עובר. לאחר מכן סנן את ההשעיה באמצעות מסנן של 20 מיקרומטר.
צנטריפוג את השעיית התאים המסוננים ב-500G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את הנוזל העליון והשאיר בערך 50 מיקרוליטר. הוסף 45 מיקרוליטר של מאגר ליזה טרי ושלב מחדש את הדגימה בזהירות.
לאחר מכן, הוסף בזהירות 50 מיקרוליטר של מאגר שטיפה מבלי לערבב את הדגימה. צנטריפוג ב-500G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הנוזל העליון ושמור את הדגימה על קרח.
בעת הצנטריפוגה, הכן את תערובת ה-TN5 לפי דגימה על ידי שילוב של 25 מיקרוליטר של מאגר TN5, 24.8 מיקרוליטר של מים נטולי נקליאזות ו-0.2 מיקרוליטר של אנזים TN5. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הנוזל העליון והשאיר את הגרעינים על קרח. הוסף 50 מיקרוליטר של תערובת TN5 לגלולה הגרעינית.
לאחר מכן, פיפט אותו למעלה ולמטה שבע פעמים כדי לערבב. התבשל ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על גוש תרמי וטפחו בעדינות על הצינור כל 10 דקות. לאחר התבשלות ה-TN5, הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר PB וערבב על ידי וורטקס במהירות מקסימלית למשך 25 שניות.
העביר את כל הנפח מהצינור לעמודת הספין. צנטריפוג בטמפרטורת החדר למשך דקה במהירות מקסימלית. הוסף 750 מיקרוליטר של מאגר PE לעמודת הספין וצנטריפוג שוב.
לאחר מכן, זרוק את הנוזל העליון עם צינור האיסוף. לאחר ספין ריק, הכנס את העמודה לצינור חדש ממוספר של 1.5 מיליליטר. הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר EB ב-37 מעלות צלזיוס למרכז העמודה מבלי לגעת בה.
השאיר אותו בטמפרטורת החדר למשך דקה. לאחר מכן, צנטריפוג למשך דקה במהירות מקסימלית בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חזור על שלבי האלציה כדי לקבל נפח סופי של 20 מיקרוליטר במאגר EB.
בצע
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מותאם לביצוע ATAC-seq (בדיקה של כרומטין נגיש לטרנספוזאז באמצעות ריצוף) בתולעי Caenorhabditis elegans שלמים בשלב התפתחותי L4. השיטה מתגברת על האתגרים המוצבים על ידי הקוטיקולה העשירה בקולגן של הנמטודה, ומאפשרת מיפוי יעיל של נגישות הכרומטין ברחבי הגנום עם מספר מינימלי של תאים. זרימת העבודה המפושטת מקלה על מחקרים של דינמיקת כרומטין בתגובה לשינויים גנטיים וסביבתיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- גנומיקה
- אפיגנטיקה
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- נגישות הכרומטין חיונית לתעתוק, לתיקון DNA ולסגרגציה של כרומוזומים.
- אזורי כרומטין בעלי נגישות גבוהה (Hyper-accessible) קשורים למעמדים (promoters) ומגבירים (enhancers) פעילים.
- שיטת ATAC-seq מאפשרת מיפוי של אזורי כרומטין נגישים ברחב הגנום תוך שימוש במספר קטן של תאים.
- היישום ב- C. elegans הוא מאתגר בשל הקוטיקולה הקולגנית הקשיחה של האורגניזם.
מטרת המחקר
- פיתוח והצגה של פרוטוקול ATAC-seq אופטימלי עבור תולעי C. elegans שלמות.
- מתן אפשרות לביצוע פרופיל נגישות כרומטין יעיל בשלב L4.
- הפחתת חסמים טכניים לביצוע ATAC-seq באורגניזם מודל זה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תרבית מסונכרנת של C. elegans בשלב L4.
- שיבוש הקוטיקולה ודיסוציאציה אנזימטית להשגת תרחיפי תאים.
- הכנת גרעינים חדירים (permeabilized) עבור טרנספוזיציית Tn5.
- הגברה באמצעות PCR וניקוי של ספריות המוכנות ל-NGS.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול דורש 30 μL בלבד של משקע תולעים.
- ניתן להשלים את כל זרימת העבודה ביום אחד.
- מייצר 5,000–9,000 שיאי נגישות כרומטין בזן הייחוס Bristol N2.
- השיטה ניתנת להתאמה לשלבי התפתחות אחרים או לאוכלוסיות תאים שפוּרואו ב-FACS.
מסקנות
- פרוטוקול ATAC-seq מיועד זה מאפשר פרופיל נגישות כרומטין חסון בתולעי C. elegans שלמים.
- הוא מרחיב את ההזדמנויות למחקר של דינמיקת כרומטין ברחבי הגנום בתגובה להפרעות שונות.
- סבב העבודה המופשט מפחית חסמים טכניים עבור חוקרים המשתמשים באורגניזם מודל זה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיפוי נגישות כרומטין ברחבי הגנום בזחלי L4 שלמים של Caenorhabditis elegans מאפשר בחינה ישירה של נופים רגולטוריים באורגניזם רב-תאי שלם. תהליך עבודה אופטימלי זה של ATAC-seq מפחית חסמים טכניים, תומך בביטחון חיזוי במחקרי רגולציה של גנים ומסייע בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של הגילוי. יכולת ההתאמה של הפרוטוקול מגבירה את ערכו עבור תיקוף מטרות ברחבי פורטפוליו ויוזמות של גנומיקה פונקציונלית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מיפוי ברזולוציה גבוהה של אזורי כרומטין נגישים לצורך תיקוף של מטרות פונקציונליות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי חשיפת פעילות של אלמנטים רגולטוריים בהקשר של אורגניזם שלם.
- מקל על חקירה מונחית-השערה של רשתות רגולטוריות של גנים הרלוונטיות למודלים של מחלות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק זרימת עבודה סטנדרטית ליצירת נתוני נגישות של כרומטין הניתנים לשחזור מכמויות דגימה קטנות.
- מספק פלטי פסגות (peaks) כמותיים המתאימים לניתוח השוואתי בין תנאים גנטיים או סביבתיים.
- מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך סריקה המשכית של הפרעות רגולטוריות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מאפשר הערכה של דינמיקת כרומטין בתגובה להפרעות גנטיות או סביבתיות במודל הרלוונטי למחלה.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי קישור שינויים רגולטוריים לתוצאות פנוטיפיות.
- מספק פלטפורמה לזיהוי ביומרקרים תרגומיים של מצב הכרומטין, כאשר הדבר נתמך על ידי מחקרים נוספים.
שילוב בצינור עיבוד ובזרימת עבודה
פרוטוקול ATAC-seq זה משתלב ברצף הגילוי, החל מאימות מטרות מוקדם ועד למחקר פרה-קליני, ומאפשר מיפוי כרומטין חסון באורגניזמים שלמים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מיפוי של אלמנטים רגולטוריים נגישים.
- סריקה: מספק נתונים כמותיים וניתנים לשחזור של נגישות כרומטין לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר ספירות שיאים (peaks) ופרופילים רחבי-גנום להשוואת מצבים רגולטוריים בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקל על חקירת שינויים בכרומטין הקשורים להפרעות רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: זרימת עבודה הניתנת להתאמה התומכת ביישום רחב בשלבים התפתחותיים שונים ובאוכלוסיות תאים מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במחקרי מנגנוני בקרה ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מייעל את פרופיל הכרומטין באמצעות פרוטוקול בר-הרחבה בן יום אחד, הדורש כמות מינימלית של חומר התחלתי.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי אספקת נתונים אפיגנומיים חסונים וניתנים לשחזור.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות ומסלולים מותאם סיכון, בהסתמכות על ראיות לנגישות כרומטין.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בנמטודות, בדיסוציאציה של תאים ובהכנת ספריות NGS.
- נדרשת גישה לתשתיות של רצף דור הבא (next-generation sequencing) ותמיכה בביואינפורמטיקה לצורך ניתוח הנתונים.
- סטנדרטיזציה בין צוותים חיונית להבטחת שחזור ויכולת השוואה בין מחקרים.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול לשלבי התפתחות אחרים או לאוכלוסיות תאים שפו purified באמצעות FACS, לפי הצורך.
- ייתכנו מגבלות טכניות הנובעות מגודל כמות הדגימות או מהיעילות של פירוק הקוטיקולה.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פרמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:23
Isolation and Dissociation of Caenorhabditis elegans into Single-Cell Suspension
2:47
Nuclei Isolation and Chromatin Tagmentation for ATAC Sequencing
5:25
ATAC Library Amplification and Cycle Optimization Using qPCR
6:36
Results
7:25
Conclusion
