בדיקת ניטרול הפחתת פלואורסצנציה של נגיף הפטיטיס E למדידת טיטרים של נוגדנים מנטרלים

המטרה העיקרית של בדיקת ניטרול מבוססת הפחתת פלואורסצנציה היא לכמת את פוטנציאל הנטרול של מועמד חיסון ונוגדנים נגד HEV. הטבע הציטופתי הידוע של HEV מגביל את בדיקת PRND. פרוטוקול זה מתמקד באימון מבוסס חיסון PRND כדי להמחיש תאים נגועים ובהמשך גם את התים המוקשים - כדי להתחיל, יש לספור את תאי HuH-7 שזה עתה חולקו.

לאחר מכן, מניחים משטח זכוכית בדרגת מיקרוסקופיה בלוח עם 12 בארות, וזרעו 0.2 מיליון תאים לבאר ב-DMEM מלא במיליליטר אחד בתוספת 10% FBS. דגרו את התאים ללילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני. ביום הבא, יש להוסיף 500 מיקרוליטר מדיה ללא סרום המכילה 1.8 כפול 10 לכוח של ארבעה עותקי גנום של g1-HEV מטוהר לתאים הזרועים.

דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך שעה. השתמש ב-500 מיקרוליטר DPBS כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים. הוסיפו שני מיליליטר DMEM עם תוספת של 2% FBS לבארות.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך 72 שעות. שטפו את התאים שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר DPBS, תוך דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בין כל שטיפה. הוסיפו 500 מיקרוליטר 4% פאראפורמלדהיד לתאים, ודגרו אותם בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.

לאחר מכן, שטפו את התאים עם DPBS כפי שהודגמו קודם. לאחר הכביסה הסופית, דגרו אותם ב-DPBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הוסיפו 250 מיקרוליטר של תמיסת חסימה המכילה 5% סרום עזים רגיל, 0.5% אלבומין סרום בקר, ו-0.3% טריטון X100 ב-DPBS.

דגרו בשייקר למשך שעה בטמפרטורת החדר. הסר את תמיסת החסימה, ושטוף פעם אחת עם 500 מיקרוליטר DPBS. לאחר מכן מוסיפים 250 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית בדילול של אחד ל-500.

דגרו את התאים בלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטוף את התאים עם DPBS שלוש פעמים כפי שהודגם קודם. הוסיפו 100 מיקרוליטר נוגדנים משניים בדילול של אחד ל-1,000, ודגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר בתא עם לחים.

בצע את מחזור הדגירה של השטיפה כפי שהודגם קודם. הוסיפו 10 מיקרוליטר ריאגנט אנטיפייד עם DAPI על שקופית זכוכית. התקן את הכיסוי עם תאים הפונים למגיב תוך הימנעות מבועות אוויר.

אטום את הכיסוי עם לק לציפורניים כדי לשמר אותו לצורך הדמיה במיקרוסקופיה קונפוקלית. ספור תאי HuH-7 שהתפוצלו זה עתה. לאחר מכן, הניחו משטח זכוכית בדרגת מיקרוסקופיה בלוח עם 12 בארות, וזרעו 0.2 מיליון תאים ב-DMEM מלא של מיליליטר אחד לכל באר.

למחרת, יש להכין דילול סדרתי פי עשרה של נוגדני אנטי-ORF2 ואימונוגלובולין ארנב G במדיה ללא סרום, עם ריכוז התחלתי של 25 מיקרוגרם למיליליטר, ועד דילול סופי של 10 עד מינוס חמש. הנפח הסופי של הדילול צריך להיות 100 מיקרוליטר. לאחר מכן, הוסף 1.8 כפול 10 לעוצמת ארבעה עותקי גנום של g1-HEV מטוהר לכל דילול נוגדן.

דגרו את תערובת הנוגדנים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך שעה. שטוף את התאים עם 500 מיקרוליטר של DPBS. הוסף תערובת וירוס הנוגדנים לתאים.

דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך שעה. שטוף את התאים עם 500 מיקרוליטר של מאגר. לאחר הוספת DMEM עם 2% FBS, דגרו במשך 72 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני.

עבד את התאים לצביעה אימונופלואורסצנטית כפי שהודגם קודם. לאחר רכישת תמונות הפלואורסצנציה, פתח את תוכנת ImageJ. בחר קובץ, ופתח את התמונה.

לאחר מכן, בחר תמונה, הקלדה, ולחץ על 8-ביט כדי להמיר את תמונת ה-RGB לפורמט 8-ביט. כוון את הסף על ידי בחירת תמונה ובחירת Adjustment, ואז Threshold, הגדרה לרמה התחתונה ל-40 והרמה העליונה ל-255. בחר ניתוח, בחר ניתוח חלקיקים, ואפשר הצגת תוצאות, ניקוי תוצאות, סיכום, החרגה בקצוות ואזורים מורכבים.

לאחר מכן לחץ על אישור כדי לקבל ספירת נקודות פלואורסצנטיות. חשב את אחוז הנטרול ואת NT50 כאנטילוג של Log10 NT50, באמצעות הנוסחה שניתנה. צייר את הגרף המציג ממוצע וסטיית תקן של כל השדות.

רמה משמעותית של חומצה ריבונוקלאית g1-HEV זוהתה בתאים נגועים לעומת תאים מזוהמים. בדיקת אימונופלואורסצנציה באמצעות נוגדן אנטי-ORF2 אישרה ביטוי ORF2 בתאי HuH-7 נגועים. טיטר הנטרול של 50% של נוגדן האנטי-ORF2 הוערך ב-2.1 כפול 10 לשלוש.

תמונות מייצגות מראות את הופעתם של תאי HuH-7 נגועים בדומה ו-g1-HEV בבדיקת ניטרול הפחתת הפלואורסצנציה. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור את פוטנציאל הנטרול של נוגדנים נגד HEV ולמדוד את מדד הנטרול של 50%. השלב הקריטי בפרוטוקול זה הוא בידוד וירוס הפטיטיס E המדבק וצביעה נכונה של תאים ורכישת תמונות ברזולוציה גבוהה.

שיטות חלופיות כמו RT-qPCR ו-ELISA יכולות לשמש לקביעת טיטר ניטרול, אך יש להן מגבלות מסוימות.