ניסויי צביעת חיסון וחדירת צבע להגדרת חלבוני צומת ספטט מקופלים בליבה באפיתל עוברי של דרוזופילה

המחקר שלנו בוחן את הפונקציות ההתפתחותיות של חלבוני מחבט מחיצים, תוך התמקדות בזיהוי ואפיון רכיבים חדשים המעורבים במבנה ובתפקידים הביולוגיים. פרוטוקול זה נועד לאפיין את ארגון ותפקוד החסימה של צמתים ספטיים מקופלים באפיתל האקטודרמלי של עוברי דרוזופילה. כדי להתחיל, יש לשלב זבובי דרוזופילה זכרים ונקביים בריאים עם הגנוטיפים המתאימים, ולמקם אותם בכלובי איסוף עוברים עם צלחות מיץ תפוחים טריים מרוחות במשחת שמרים.

אפשר לבוגרים להטיל ביצים מופרות על צלחות מיץ התפוחים. הסר את הצלחת מכלוב איסוף הביצים והזדקן את העוברים ל-13 עד 16 שעות לאחר הטלת הביצים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס כדי להגיע לשלב 16. לאחר מכן מקבעים את העוברים בשלב 16 בתמיסה מתאימה ומבצעים צביעת חיסון עם הנוגדנים הרצויים.

לתוצאות מיטביות, צילם את העוברים במיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה של טבילה בשמן פי 40. לאחר התמקדות בעובר המעוניין, כוון את עוצמת הלייזר והגבר כדי להשיג אות פלואורסצנטי חזק מבלי להעלות רוויה יתר על הפיקסלים. זיהוי עוברים בשלב 16 שאינו מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק מקודד במאזן, באמצעות מורפולוגיה של מערכת העיכול המרכזית.

למקד את הסריקה על בלוטת הרוק או המעי האחורי, ומקם את סריקת ה-Z כך שתכלול את הקוטר הגדול ביותר האפשרי של הלומן כדי לראות את הממברנה הצדדית המלאה של תא האפיתליאל. קבעו ממוצע קו מתאים ודמיינו רקמה מקוטבת לפחות ב-20 עוברים בקבוצת ביקורת ו-20 עוברים בשלב 16 מוטנטי של קורה 4. רשמו נתונים רק מעוברים שבהם סמן חיבור ההיצמדות ממוקם היטב באזור האפיקלי-לטרלי של הממברנה.

בעוברים מסוג פראי בשלב 16, יש להעריך את ההעשרה של חלבוני מחיצת ספט מקופלים לאורך האזור האפיקלי של הממברנה הלטרלית סמוך לצומת הדביקות. לתעד את ההתפלגות המתמשכת של סמן המפגש הקפלי לאורך כל הממברנה הצדדית במוטנט. הכינו תמיסת צבע טרייה על ידי המסה של 10 קילודאלטון דקסטרן מסומן ברודמין ל-1 מיליגרם למיליליטר בפוספט נתרן 0.5 מולרי ב-pH 7.5, עם כלוריד אשלגן 5 מילימולר.

באמצעות מושך מחטים, משוך צינור קפילרי בקוטר 1 מילימטר בקוטר פנימי בקוטר 0.5 מילימטר עם סיבים, לתוך מחט זכוכית. לאחר מכן, טען את מחט הזכוכית לתוך מחזיק המחט במיקרומניפולטור וסדר את המיקרומניפולטור ליד מיקרוסקופ הפוך. כוון את המחט כמה שיותר קרוב למקביל למחסנית המיקרוסקופ, והנמיך אותה לאותו מישור Z כמו צד המחסנית.

שברו את קצה המחט על ידי הקפתה בצד של מגלש המיקרוסקופ. הרם את המחט מעל גובה הסלייד והסר אותה לטעינה. לאחר מכן, מלא את הצינור הקפילרי בצבע באמצעות קצה הפיפטה הקטן ביותר הזמין.

טען מחדש את המחט המלאה לתוך מחזיק המחט. בדקו את זרימת הדקסטרון של 10 קילודלקון על ידי הזרקת כמות קטנה לטיפה של שמן הלוקרבון על פני השטח של מגלשת מיקרוסקופ. באמצעות מכסה בעובי 2 בגודל 22 על 22 מילימטר, צור קו שקוע על צלחת מיץ תפוחים.

מיישר כ-25 עוברים כל אחד בשליטה וכ-Cora 4 מוטנט בשלב 16 או 17 על צלחת מיץ התפוחים. ודא שהקצוות האחוריים שלהם מיושרים לאורך הקו, ושהמשטחים הגחניים פונים כלפי מעלה. לאחר מכן הדביקו חתיכת סרט דו-צדדי על כיסוי מספר 2 בגודל 22 על 22 מילימטר.

נגעו בסרט על קו העובר ושפשפו בעדינות את הכיסוי כדי להעביר את העוברים מהצלחת אל הסרט הדו-צדדי. לאחר מכן, הוסיפו טיפה של שמן הלוקרבון למחסנית מיקרוסקופ וחברו את הכיסוי למחסנית על ידי מתן אפשרות לפעולה קפילרית ליצירת קשר. כוון את הכיסוי קרוב יותר לצד המגלשה מול כל חלק מטושטש.

ייבשו את העוברים למשך שלוש עד חמש דקות במיכל של חומר ייבוש, וכסו את העוברים לחלוטין בשמן הלוקרבון. התקן את המחסנית עם העוברים על המיקרוסקופ ההפוך כאשר העוברים פונים כלפי מעלה ורחוק מהמטרה. יישר את המיקרומניפולטור כך שהמחט פונה לקצה האחורי של העוברים בזווית קרובה ככל האפשר לעוברים, והתאימו את ציר ה-Z של המיקרומניפולטור כך שקצה המחט יתיישר עם נקודת האמצע של העובר לאורך הציר הגבי-וונטרלי.

לאחר מכן, הזרקת העוברים על ידי הזזת השלב במהירות לתוך המחט כך שקצה המחט ייכנס להמוקואל. הזרקו כ-0.2 עד 0.5 ננוליטר צבע באמצעות מזרק בנפח 10-25 או 50 מיליליטרים. משכו במהירות את המחט והעבירו את השלב לעובר הבא להזרקת צבע.

לאחר מכן הוסיפו שמן הלוקרבון נוסף על העוברים. כסו את העוברים בכיסוי מספר 2 בגודל 22 על 22 מ"מ כדי ליצור שכבת שמן אחידה בין הכיסוי ולמנוע ריסוק. בצע הדמיה במיקרוסקופ פלואורסצנטי או מיקרוסקופ קונפוקלי לאחר הזרקת צבע דקסטרן.

במיקרוסקופ הקונפוקלי, יש לרכוש ערימת Z דרך כרבע מעומק העובר לאורך הציר הדורסלי-ונטרלי כדי להעריך את הלומן של קנה הנשימה. בדקו את הלומן של קנה הנשימה, בלוטת רוק או מעי אחורי לצורך הצטברות דקסטרן מסומן. רשמו את הגנוטיפ ושלב ההתפתחות של כל עובר והאם דקסטרון מסומן מצטבר באיבר צינורי כלשהו.

שימו לב לעוברים שבהם המרחב הפריוויטליני מוכתם חזק בצבע, שכן הם עשויים לייצג הזרקה לא מכוונת למרחב זה. בעוברים מסוג פראי, מקוגלובולין הקשור למשלים (Mcr), היה ממוקם באופן אחיד לאורך הממברנה הצדדית בשלב 13, הועשר באזור האפיקלי של הממברנה הלטרלית בשלב 14, והיה ממוקם מאוד באזור האפיקלי-לטרלי, רק בסיסי לצומת הדבקים בשלב 16. צביעת נוגדנים קורטיקלית הגדירה את מפגשי המחיצות המקופלים הבוגרים בעוברים מסוג בר בשלב 16, בדומה ל-Mcr.

בעוברים מוטנטיים של קורה 4, Mcr לא הצליח להשיג מיקום אפיקלי חזק בשלב 16 ונשאר מפוזר לאורך הממברנה הצידית. המיקום של E-cadherin היה דומה בעוברים מסוג Wild ו-Cora 4 בשלב מוטנטי 16. בעוברים מסוג פראי שלב 17 שהוזרקו בדקסטרן 10 קילודאלטון מסומן ברודמין, הצבע הקיף את קנה הנשימה אך לא חדר ללומן.

בעוברים מוטנטיים בשלב 17 של קורה 4, הצבע הצטבר בלומן של קנה הנשימה תוך 10 דקות מההזרקה. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לקבוע בביטחון האם גן מקודד את הליבה או את הרכיב המשני של מחברי המחיצה המקופלים ברקמות העובר של דרוזופילה. שלב עוברים הוא קריטי בביצוע טכניקה זו, שכן זה דורש עוברים בשלב 16.

צמתי הספטה מתבגרים עם הזמן עד שהם מתבססים לחלוטין בשלב 16. אנו מאמינים שניתן ליישם את הפרוטוקול הזה ביעילות בסקר גנטי פתוח באמצעות קווי הפרעת RNA לזיהוי גנים חדשים של חיבור ספטיט מקופל.