Name: בדיקת ממוספירה חושפת גבעול מושרה על ידי API 5 בקווי תאים אפיתליים של השד שאינם גידוליים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: חקור את השפעת יתר-ביטוי Api5 על תאי אפיתל שד שאינם גידוליים באמצעות מבחן ממוספירה. הפרוטוקול מאפשר הערכת תכונות תאי גזע סרטניים כולל רניוול עצמי וביטוי סמני פלוריפוטנטיות בקו תאי MCF-10A.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. ציפוי לוחות תרבית רקמה ב-Poly(2 -hydroxyethyl methacrylate), pHEMA
<ol>
	<li>המיס 1.2 גרם pHEMA (משקל מולקולרי ̴ 300,000) ב-100 מ"ל של 95% אתנול על ידי ערבוב מתמשך בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס להכנת תמיסת pHEMA של 1.2% (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>ציפוי לוחות תרבית רקמה סטנדרטיים ב-pHEMA על ידי מריחת 1 מ"ל לבאר של צלחת 6 בארות. נפח תמיסת ה-pHEMA ניתן לכוונון בהתאם לגודל כלי תרבית הרקמה.</li>
	<li>אפשר לצלחות להתייבש בתנור בטמפרטורה של 40°C בתנאים סטריליים.</li>
	<li>חשפו את הלוחות לאור UV למשך 15 דקות, ואחריהם שלושה שטיפות עם תמיסת מלח מפוזרת-פוספט (DPBS) של דולבקו, לפני השימוש בהן להכנת בדיקת היווצרות הממוספירה.</li>
</ol>
2. זריעת ממוספרות מהדור הראשוני
<ol>
	<li>תרבית תאי MCF10A מפורקים בתלת-ממד (הבעה יתר של Control ו-Api5) שהושגו על ידי פירוק יום 16 של תרביות תלת-ממד במדיום גדילה14. הערה: הרכב מדיום הגידול: רמות רמות גבוהות של סוכר DMEM ללא פירובאט נתרן בתוספת 5% סרום סוס, 10 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון, 20 ng/mL גורם גדילה אפידרמלי רקומביננטי אנושי (EGF), 100 ng/mL רעלן כולרה, ו-200 יחידות/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>הסר את המדיום המשומש, שטוף את התאים ב-1 מ"ל DPBS, ואז מוסיפים 500 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין-אדטה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנור לחות עם 5%CO2 למשך 12-15 דקות עד שכל התאים מתפרצים.</li>
	<li>לאחר שכל התאים משתחררים, הוסף 2 מ"ל של מדיום תלייה מחדש כדי לנטרל את פעילות הטריפסין וסובב את תליית התא ב-112 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: הרכב מדיום ההשעיה מחדש: רמת רמות גבוהות של סוכר DMEM ללא פירובט נתרן בתוספת 20% סרום סוס, ו-200 יחידות למ"ל פניצילין-סטרפטומיצין.</li>
	<li>שאיפת הסופרנטנט והשתה מחדש את כדור התא ב-1 מ"ל של תווך ממוספירה. מעביר את מתלה התא דרך מחט 25 G כדי לקבל מתלה חד-תאים. הערה: הרכב מדיום הממוספירה: DMEM/F12 עם תוספת של 20 ng/mL גורם גדילה אפידרמלי (EGF), תוסף B27 אחד × ללא ויטמין A, ו-200 יחידות/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין ( ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>באמצעות המוציטומטר, ספרו את מספר התאים ומחשבו את נפח ההשעיה התאית הנדרש לזריעה של 0.2 ×-10-4 תאים בכל באר. הערה: לשמור על צפיפות זריעה נמוכה כדי לקבוע במדויק את יעילות היווצרות הממוספירה, ובכך למזער את השפעת הצטברות התאים. כאשר אוספים ליזאטים של חלבון לאימונובלוטינג, ניתן להגדיל את צפיפות התאים עד 2.5 ×-10-5 תאים בכל באר.</li>
	<li>מדלל את נפח המתלים התאים הנדרש ב-2 מ"ל של מדיום ממוספירה וזרע בכל באר של פלטת 6 בארות. תאי זרע בשלושה עותקים לכל מצב.</li>
	<li>דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לחות עם 5%CO2 למשך 7 ימים.</li>
	<li>לאחר שבעה ימים בתרבית, יש לספור ידנית את מספר הממוספרות בקוטר העולה על 50 מיקרון בכל באר, באמצעות מיקרוסקופ מצויד בגרטיקול או באמצעות רשת רבעים תחת מיקרוסקופ אור.</li>
	<li>דמיינו את הממוספירות באמצעות מצלמה דיגיטלית המותקנת על מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 20.</li>
	<li>חשב את יעילות היווצרות הממוספירה (MFE) באמצעות הנוסחההבאה 5 
	 <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq1v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 1"></li>
</ol>
3. זריעת ממוספירות מדור משני
<ol>
	<li>אסוף את הממוספירות שנוצרו בדור הראשון בצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שאפו את הסופרנאנט, והשאירו מאחור את כדור הממוספירה.</li>
	<li>שטוף את הכדור עם DPBS.</li>
	<li>הוסיפו 200 מיקרוליטר 0.05% טריפסין-EDTA לגלגור הממוספירה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לחות עם 5%CO2 למשך 2-3 דקות. העבירו את הממוספירות בתמיסת הטריפסין דרך מחט 25 G שלוש פעמים כדי לקבל תלייה חד-תאית.</li>
	<li>הוסיפו 0.5 מ"ל מדיום תלייה מחדש כדי לנטרל את פעילות הטריפסין וסובבו את תליית התא ב-112 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שאופי את הסופרנטנט והשלים מחדש את כדור התא ב-0.5 מ"ל של מדיום ממוספרה.</li>
	<li>באמצעות המוציטומטר, סופרים את מספר התאים ומחשבים את נפח ההשעיה התאית הנדרש לזריעת 0.2 ×-10-4 תאים לבאר. הערה: לשמור על צפיפות תאים נמוכה כדי להעריך את יכולת ההתחדשות העצמית, ובכך למזער את השפעת הצטברות התאים.</li>
	<li>מדלל את נפח המתלים התאים הנדרש ב-2 מ"ל של מדיום ממוספירה וזרע בכל באר של פלטת 6 בארות. תאי זרע בשלושה עותקים לכל מצב.</li>
	<li>דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לחות עם 5%CO2 למשך 7 ימים.</li>
	<li>לאחר 7 ימים בתרבית, ספרו את מספר הממוספירות בקוטר מעל 50 מיקרון בכל צלחת באמצעות מיקרוסקופ המצויד בגרטיקול או רשת רבעים.</li>
	<li>דמיינו את הממוספירות באמצעות מצלמה דיגיטלית המותקנת על מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 20.</li>
	<li>חשב את קיבולת החידוש העצמי באמצעות הנוסחההבאה 5 
	<img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq2v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 2"></li>
</ol>
4. בלטינג מערבי לזיהוי שינויים בסמני פלוריפוטנטיות בעקבות ביטוי יתר של Api5
<ol>
	<li>אסוף את הממוספירות שנוצרו בדור הראשון בצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שאפו את הסופרנאנט, והשאירו מאחור את כדור הממוספירה.</li>
	<li>שטוף את הכדור עם DPBS.</li>
	<li>לאסוף את הכדור בבופר קר של RIPA כדי לקבל את החלבון ליזאט ולבצע אימונובלוטינג לפי הפרוטוקול הסטנדרטי24. הערה: הרכב בופר RIPA: 50 מ"מ טריס-HCl (pH 8.0), 150 מ"מ NaCl, 1% טריטון X-100, 0.5% נתרן דה-אוקסיכולט, 0.1% נתרן דודציל סולפט (SDS), 1 מ"מ אתילנדיאמינטטטראצטית (EDTA), 1 מ"מ פנילמתיסולפוניל פלואוריד (PMSF), 10 מ"מ פלואוריד נתרן (1 מ"מ נתרן, 1 מ"מ נתרן אורתובנדט).</li>
	<li>בדיקה לסמני גבעול - Oct3/4, Nanog, Sox2 ו-Bmi1, ובקרת עומס GAPDH (ראו טבלת חומרים לדילול נוגדנים).</li>
	<li>כמת את רמות החלבון באמצעות ניתוח צפיפות ב-ImageJ. בחר את אזור העניין בתמונות Western Blot ויצר פרופיל צפיפות לכל נתיב.</li>
	<li>נרמול הצפיפות היחסית של החלבון המעניין לאלו של GAPDH עבור כל נתיב. חשב את שינוי הקיפול עבור כל חלבון.</li>
	<li>שרטט את שינוי הקיפול ברמות החלבון באמצעות כל תוכנת גרוטינג.</li>
</ol>

<ol><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).</li>
<li>Creighton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (33), 13820-13825 (2009).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Grimshaw, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Res. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Kim, R. J., Nam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OCT4+expression+enhances+features+of+cancer+stem+cells+in+a+mouse+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Res%22%5BJournal%5D)">OCT4 expression enhances features of cancer stem cells in a mouse model of breast cancer.</a> Lab Anim Res. 27 (2), 147-152 (2011).</li>
<li>Lu, X., Mazur, S. J., Lin, T., Appella, E., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pluripotency+factor+nanog+promotes+breast+cancer+tumorigenesis+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The pluripotency factor nanog promotes breast cancer tumorigenesis and metastasis.</a> Oncogene. 33 (20), 2655-2664 (2014).</li>
<li>Leis, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+expression+in+breast+tumours+and+activation+in+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).</li>
<li>Paranjape, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+self-renewal+and+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+breast+cancer+cells+through+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates self-renewal and epithelial to mesenchymal transition in breast cancer cells through Nanog.</a> BMC Cancer. 14 (1), 785(2014).</li>
<li>Bousquet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+apoptosis+protein+%28Api-5%29+in+chemoresistant+triple-negative+breast+cancers%3A+an+innovative+target%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High expression of apoptosis protein (Api-5) in chemoresistant triple-negative breast cancers: an innovative target.</a> Oncotarget. 10 (61), 6577-6588 (2019).</li>
<li>Basset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Api5+a+new+cofactor+of+estrogen+receptor+alpha+involved+in+breast+cancer+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Api5 a new cofactor of estrogen receptor alpha involved in breast cancer outcome.</a> Oncotarget. 8 (32), 52511-52526 (2017).</li>
<li>Kuttanamkuzhi, A., Panda, D., Malaviya, R., Gaidhani, G., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+anti-apoptotic+protein+Api5+affects+breast+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Altered expression of anti-apoptotic protein Api5 affects breast tumorigenesis.</a> BMC Cancer. 23 (1), 374(2023).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor-5+overexpression+is+associated+with+tumor+progression+and+poor+prognosis+in+patients+with+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor-5 overexpression is associated with tumor progression and poor prognosis in patients with cervical cancer.</a> BMC Cancer. 14 (1), 545(2014).</li>
<li>Jang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+induces+cisplatin+resistance+through+FGFR+signaling+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">API5 induces cisplatin resistance through FGFR signaling in human cancer cells.</a> Exp Mol Med. 49 (9), e374(2017).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+increases+metastasis+via+Erk-mediated+MMP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 increases metastasis via Erk-mediated MMP expression.</a> BMB Rep. 48 (6), 330-335 (2015).</li>
<li>Krejci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiapoptotic+protein+Api5+and+its+partner%2C+high+molecular+weight+FGF2%2C+are+up-regulated+in+B+cell+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The antiapoptotic protein Api5 and its partner, high molecular weight FGF2, are up-regulated in B cell chronic lymphoid leukemia.</a> J Leukoc Biol. 82 (6), 1363-1364 (2007).</li>
<li>Koci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+%28API-5%3B+AAC-11%3B+FIF%29+is+upregulated+in+human+carcinomas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 (API-5; AAC-11; FIF) is upregulated in human carcinomas in vivo.</a> Oncol Lett. 3 (4), 913-916 (2012).</li>
<li>Phi, L. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+%28CSCs%29+in+drug+resistance+and+their+therapeutic+implications+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells (CSCs) in drug resistance and their therapeutic implications in cancer treatment.</a> Stem Cells Int. 2018 (1), 5416923(2018).</li>
<li>Zhou, H. M., Zhang, J. G., Zhang, X., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+stem+cells+for+reversing+therapy+resistance%3A+mechanism%2C+signaling%2C+and+prospective+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer stem cells for reversing therapy resistance: mechanism, signaling, and prospective agents.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 62(2021).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+confers+cancer+stem+cell-like+properties+through+the+FGF2-NANOG+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">API5 confers cancer stem cell-like properties through the FGF2-NANOG axis.</a> Oncogenesis. 6 (1), e285(2017).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-nitroso-N-ethylurea+activates+DNA+damage+surveillance+pathways+and+induces+transformation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells.</a> BMC Cancer. 14 (1), 287(2014).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3Aa+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open:a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Eyre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+mammosphere+and+xenograft+tumour+initiation+correlates+with+progression+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Patient-derived mammosphere and xenograft tumour initiation correlates with progression to metastasis.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 99-109 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin EDTA&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C humidified incubator</td><td>New Brunswick</td><td>Galaxy 170 R</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bmi1 Rabbit pAb</td><td>ABclonal</td><td>A13472</td><td>1:1000 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antibody</td><td>Sigma</td><td>G9545-200UL</td><td>1:10000 dilution, 1 h incubation at room temperature</td></tr><tr><td>Anti-Nanog Rabbit mAb</td><td>ABclonal</td><td>A22625</td><td>1:5000 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Oct3/4 Antibody (C-10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:300 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antibody (E-4)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365823</td><td>1:300 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), minus vitamin A</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td>&nbsp;1 mg/mL stock in dH2O</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor (EGF)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E9644-0.2MG&nbsp;</td><td>100 mg/mL stock in dH2O</td></tr><tr><td>Ethanol absolute 99.9%</td><td>Jebsen &amp; Jessen GmbH &amp; Co. Germany</td><td>58051 L05</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>SRL</td><td>43272</td><td></td></tr><tr><td>High glucose DMEM without sodium pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Qualigens</td><td>Q29145</td><td>Used to adjust pH of Tris-HCl (pH 8.0)</td></tr><tr><td>Hydrocortisone&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;&nbsp;</td><td>H0888</td><td>1 mg/mL stock in ethanol</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Image processing software</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western chemiluminiscent HRP substrate</td><td>Merck</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I1882&nbsp;</td><td>10 mg/mL stock in 1% glacial acetic acid</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS-100 microscope</td><td>Nikon</td><td>BM-1919</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A cells</td><td></td><td></td><td>Gift from Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA)</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethysulphonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>78830-5G</td><td></td></tr><tr><td>Plotting software&nbsp;</td><td>GraphPad Prism 10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA)</td><td>Santacruz</td><td>sc-253284</td><td>1.2% pHEMA in 95% ethanol</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>SRL</td><td>41721</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Amresco</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td><td>SRL</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride (NaF)</td><td>HiMedia</td><td>RM1081-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>SRL</td><td>71033</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת ממוספירה חושפת גבעול מושרה על ידי api 5 בקווי תאים אפיתליים של השד שאינם גידוליים

Mammosphere Assay Reveals Api5-Induced Stemness in Non-Tumorigenic Breast Epithelial Cell Lines

כדי להעריך את יעילות היווצרות הממוספירה בתנאים שאינם דבקים, הוזרעו תאי בקרה ותאי MCF10A תלת-ממדיים מפורקים ב-Api5 על לוחות מצופים פולי-HEMA בהתאם לפרוטוקול. תאים בעלי ביטוי יתר של Api5 הראו עלייה פי 1.58 ביעילות היווצרות הממוספירה הממוצעת לעומת תאי הביקורת (איור 1B,C). עלייה זו מראה כי ביטוי גבוה יותר של Api5 מגדיל את שיעור האבות הדמויי תאי גזע ששורדים ומתרבים בתנאים שאינם דבקים וחסרי סרום, מה שמוביל להיווצרות כדורים שמקורם בקלון.
הממוספירות הראשו...

בדיקת ממוספירה חושפת גבעול מושרה על ידי API 5 בקווי תאים אפיתליים של השד שאינם גידוליים

Breast cancer remains the most prevalent cancer among women globally, with the highest age-standardised incidence and mortality rates. Despite the ...

mammosphere-assay-reveals-api5-induced-stemness-non-tumorigenic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מתאר בידוד תאי גזע סרטניים משורות תאי סרטן השד. אנו מגדלים תאי גזע סרטניים אלה כדי ליצור ממוספרות ראשוניות להערכת התחדשות עצמית ולחישוב יעילות יצירת הכדורים, מה שמאפשר השוואה בין צפיפויות זריעה שונות.

יצירת ממוספרות ראשוניות: טכניקה לקביעת עוצמת התא

שיטה לעיבוד חומרי פסולת אנושיות חלב כירורגית מתוארת. רקמת מעובד, בצורה של organoids, ניתן לאחסן קפוא ללא הגבלה זמן או להציב בתרבות לצמיחה לטווח ארוך. שיטה זו מאפשרת בדיקה ניסיונית של ביולוגיה של תא נורמלית אנושית אפיתל, ואת ההשפעות של הפרעות חיצוניות.

עיבוד של הפחתה מאמופלסטית אדם ורקמות כריתה לתא תרבות

הדמית זמן לשגות משמשת כדי להעריך את ההתנהגות של תאים ראשוניים preneoplastic חלב האפיתל הנגזרים ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סיכון לסרטן שד על מנת לקבוע אם יש קשר בין פרמטרים התנהגותיים ספציפיים ונגעים גנטיים מובחנים.

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

תרבית תאים ראשונית באמצעות organoids רקמה שלמה מספקת מערכת מודל המחקה את המיקרו-הסביבה רב-התאית בגוף חי. פיתחנו מודל סרום ללא עיקרי רקמת האפיתל שד תרבות המנציח שושלות מעורבות תרבית תאים ותערוכות מובחנות מורפולוגיה, ללא הפרעה רקמה האנזימטית. organoids השד בר-קיימא ל&gt; 6 חודשים.

אינו אנזימטית, תרבות רקמות סרום ללא נגעי שד טרום פולשני לדור ספונטני של Mammospheres

מבחני מבחנה משמשים בדרך כלל לזיהוי תאי גזע סרטניים. כאן אנו משווים מבחני כדורים בודדים עם רב-תאים מבוססי תאים. הבדיקות המבוססות על תאים בודדים או תוספי מתיל צלולוז נותנים תוצאות מדויקות יותר בעוד שבדיקות מבוססות תאים מרובות תאים המבוצעות במדיום נוזלי יכולות להיות מושפעות מאוד מצפיפות התאים.

הערכה של מאפייני תא גזע בקרצינומה של תאי השחלות אדם באמצעות Multi ומבחני Spheres מבוסס תא בודדים

בדיקות ממוספירה צפה יכולות לחקור את תת-הקבוצה של תאי סרטן שד דמויי גזע ששורדים בתנאי השעיה ומראים גידול משופר כאשר הם מושתלים בעכברים.  פרוטוקול זה מספק מדד נוח במבחנה של יכולת יצירת כדור, פרוקסי לגידול in vivo, תוך הקלה על ניתוח נוף השעתוק הקשור לגבעול.

Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

מטרת מתודולוגיה זו היא לזהות את תאי גזע הסרטן (csc) בקווי התאים של סרטן ודגימות הגידול האנושי הראשוני עם הפרוטוקול ליצירת כדור, בצורה איתנה, באמצעות בחני פונקציונלי ואפיון פנוטימית עם זרימה cy, try ומערבי מחוק.

קבלת סרטן גזע כדורים מגינקולוגית סרטן השד גידולים

כאן אנו מתארים את ההטמעה והפרשנות של התוצאות של שיטת ההתחדשות הכמותית העצמית של ממוגרפיה.

קוונפיקציה של התחדשות עצמית בתרבויות מורנה במוספירה

פרוטוקול זה מספק כלים ניסיוניים במבחנה כדי להעריך את הטרנספורמציה של תאי אם אנושיים. מתוארים שלבים מפורטים לקצב התפשטות תאים, יכולת צמיחה בלתי תלויה בעיגון והפצה של שושלת תאים בתרבויות תלת-מימד עם מטריצת קרום מרתף.

הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

פרוטוקול ניסיוני זה מתאר את הבידוד של BCSCs מדגימות תאים ורקמות של סרטן השד, כמו גם את מבחני in vitro ו - in vivo שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את הפנוטיפ והתפקוד של BCSC.

בידוד והערכה תפקודית של תאי גזע מסרטן השד האנושי מדגימות תאים ורקמות

פרוטוקול זה מתאר גישת סקר CRISPR תוך-צינורית ניתנת להרחבה, המאפשרת מחקרים מקבילים של הכיבוי וההפעלה של הגנים בחיים בבלוטת השד של העכבר.

סקר מקביל ב-vivo של השמדת גנים והפעלה בבלוטת השד של העכברים

חקור את השפעת יתר-ביטוי Api5 על תאי אפיתל שד שאינם גידוליים באמצעות מבחן ממוספירה. הפרוטוקול מאפשר הערכת תכונות תאי גזע סרטניים כולל רניוול עצמי וביטוי סמני פלוריפוטנטיות בקו תאי MCF-10A.

בדיקת ממוספירה חושפת גבעול מושרה על ידי API 5 בקווי תאים אפיתליים של השד שאינם גידוליים

גלה סרטונים נוספים